专利名称：P物质用于间充质干细胞的动员或增殖以及用于伤口愈合或促进伤口愈合的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用P物质(Substance-P)制造从骨髓动员或增殖间充质干细胞(MSC)，或促进所述动员或增殖的药物的用途，以及利用P物质制造用于伤口愈合或促进伤口愈合的药物的用途。
背景技术：
P物质是由11个氨基酸组成的神经肽，这个速激肽家族在感觉神经元、巨噬细胞、嗜曙红细胞、内皮细胞、和角膜的细胞，例如上皮细胞和角膜细胞，以及肉芽组织中表达。一些报道已经提出在造血调节中的神经免疫通讯中涉及有P物质。骨髓基质受P物质神经纤维的支配，并且P物质刺激了骨髓基质细胞通过其表面受体NK-1来产生干细胞因子和白介素-1，这些可能是作为滋养有利于造血刺激。但是，在全身MSC动员和骨髓中的MSC再增殖中P物质的作用还没有报道。
伤口本身创造了一个独特和特异的微环境，这个环境由生长因子、细胞因子、神经激素、和细胞外基质组成，所有这些都是由邻近细胞，血生细胞和感觉神经元分泌的。在伤口微环境中有些因子可能持续足够长的时间而扩散到外周血中，并且依次影响骨髓中的干细胞，来诱导骨髓细胞动员进入外周血，促使向伤口位置提供骨髓细胞，以及促进骨髓细胞参与伤口愈合。
最近使用骨髓干细胞和培养的MSC进行的细胞移植试验显示其与肺、胃肠道、和梗塞的心肌的组织修复有关。但是，在正常的没有创伤的生理学状态下，除了骨髓，在诸如脂肪组织和翼状胬肉的组织中检测到MSC，但是其很少出现在外周血中。由此，认为在组织修复和病理进展过程中，可能有某个系统将MSC从骨髓动员到其他外周组织中去。
角膜是由透明的，无血管的且受密集神经支配的组织组成，其完整性可能在角膜损伤和角膜疾病的情况下被破坏。角膜伤口刺激角膜上皮细胞的横向运动，这很可能是由角膜缘干细胞提供的，其还刺激了炎症细胞的浸润，和伤口基质内新血管的形成，所有这些可能是受独特的角膜伤口微环境的刺激。以前的报告提出，角膜的去神经支配是在伤口愈合过程中实际延迟的一个原因，并且在糖尿病病人中P物质的水平低于非糖尿病病人，这也是引起延迟表皮再殖和延迟愈合的一个原因。由于角膜表面广泛受到三叉神经节神经元的支配，并且内源性的P物质在角膜上皮细胞和角膜细胞中表达，人们预期P物质与伤口微环境有关并且参与角膜修复。
发明概述本发明人发现P物质是在角膜碱灼伤的小鼠的眼睛和外周血中增多的第一个神经肽。并且，他们发现，即使将P物质静脉注射进角膜无伤口的小鼠中，很多CD29+MSC还是被动员进入外周血。而且，在体外的3-D胶原凝胶中显示P物质通过诱导基质降解酶和抑制该酶的抑制剂来刺激人MSC的迁移。而且，他们发现P物质刺激MSC的细胞增殖，β-连环蛋白的细胞核转位作用，及其目标基因VEGF和纤连蛋白的表达，并且因此P物质可能在MSC动员之后在MSC的骨髓再增殖中起作用。而且，本发明人确定了输入碱灼伤的兔子耳静脉的Di 1标记的MSC在伤口床处被成功动员起来，并且促进了角膜伤口的愈合，改善角膜的透明度和视力恢复。进一步的，他们显示了静脉注射的P物质能够促进碱灼伤的兔眼的伤口愈合。
因此，本发明的首要目的是提供P物质用于制造从骨髓动员或增殖间充质干细胞(MSC)，或促进所述动员或增殖的药物的用途。
本发明的第二个目的是提供P物质用于制造伤口愈合或促进伤口愈合的药物的用途。
本发明的第三个目的是提供用于从骨髓中动员或增殖MSC，或促进所述动员或增殖的制剂，其含有P物质作为有效成分。
本发明的第四个目的是提供一种伤口愈合或促进伤口愈合的制剂，其含有P物质作为有效成分。
本发明的第五个目的是提供一种伤口愈合或促进伤口愈合的制剂，其含有MSC作为有效成分，其中，通过P物质的处理来从骨髓中动员或增殖MSC。
本发明的第六个目的是提供一种分离MSC的方法，包含通过P物质处理从骨髓动员MSC的步骤。
本发明的第七个目的是提供一种增殖MSC的方法，包含在有P物质存在下增殖MSC的步骤。
本发明的第八个目的是提供一种愈合伤口或促进伤口愈合的方法，包括施用治疗有效量的P物质。
本发明的第九个目的是提供一种愈合伤口或促进伤口愈合的方法，包括施用治疗有效量的MSC，其中通过P物质的处理从骨髓动员或增殖MSC。
附图简述
图1显示了在角膜碱灼伤后，在兔子的外周血和伤口床中c-kit+干细胞的增加(用箭头指示伤口床处的c-kit阳性细胞)。
图2a显示了在角膜碱灼伤之后，小鼠眼睛的RT-PCR分析结果。
图2b显示了小鼠角膜碱灼伤之后的第0、1、3、5、7、10、14天收集的外周血的ELISA分析结果。
图2c显示了小鼠眼睛碱灼伤之后伤口床的苏木精&曙红染色结果，以及P物质抗体免疫组化染色的结果。
图2d显示了小鼠眼晴碱灼伤之后的伤口处用c-kit、CD-29、和α-SM肌动蛋白的抗体进行免疫组化染色的结果。
图3a显示了在静脉注射P物质之后从小鼠血液中分离出的粘附细胞中用CD-29抗体免疫细胞化学染色的结果。
图3b是显示在静脉注射P物质之前或之后的血液中CD-29+细胞平均数量的图表。
图4a显示了应答P物质处理在3-D胶原凝胶上人MSC的迁移和胶原蛋白降解的结果。
图4b显示了在用P物质(0-100nM)处理后，从培养在3-D胶原凝胶上的人MSC收集的培养物上清液的明胶酶谱分析结果。
图4c显示了在用P物质(0-100nM)处理后从人MSC收集的培养物上清液中针对MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的抗体的免疫沉淀结果。
图5a是显示在用P物质处理后，存活的人MSC的数量(n＝4，平均数±S.D)的图表。
图5b显示了在P物质(0-100nM)存在下培养的人MSC用β-连环蛋白抗体的免疫荧光染色结果。
图5c是从P物质处理过的人MSC的培养物上清液中收集的VEGF的ELISA分析结果的图表。
图5d显示了从P物质处理的人MSC的培养物上清液中使用针对人类纤连蛋白的单克隆抗体的Western印迹分析结果。
图6a显示了角膜碱灼伤后的第14、30天，有或没有Di 1标记的兔MSC输注的兔眼裂隙灯检查结果照片。
图6b显示了通过荧光立体显微镜的FLAT mount检查观察到的角膜中Di 1标记的MSC存在的照片。
图7a显示了静脉注射或没有注射P物质的兔子角膜碱灼伤之后，角膜伤口恢复的照片。
图7b显示了在角膜碱灼伤之后，静脉注射或没有注射P物质的组织切片的H&E染色结果的照片。
图7c显示了在角膜碱灼伤之后静脉注射或没有注射P物质的组织切片中，用CD-29抗体免疫组化染色的照片。
发明详述首先，本发明涉及P物质用于制造从骨髓动员或增殖间充质干细胞(MSC)，或促进所述动员或增殖的药物的用途。在一个实施方案中，所述药物可以包括MSC。在另一个实施方案中，所述药物可以是细胞性治疗剂。
第二，本发明涉及P物质用于制造伤口愈合，例如角膜和皮肤伤口愈合或促进伤口愈合的药物的用途。在一个实施方案中，所述药物可以包括MSC。在另一个实施方案中，所述药物可以是细胞性治疗剂。
第三，本发明涉及一种用于从骨髓中动员或增殖MSC，或促进所述的动员或增殖的制剂，其包含P物质作为有效成分。
第四，本发明涉及一种伤口愈合，或促进伤口愈合的制剂，包含P物质作为有效成分，例如，用于角膜和皮肤伤口。
第五，本发明涉及一种伤口愈合，或促进伤口愈合的试剂，其含有MSC作为有效成分，其中通过P物质的处理来从骨髓中动员或增殖MSC。
第六，本发明涉及一种分离MSC的方法，包括通过P物质的处理来从骨髓中动员MSC的步骤。
第七，本发明涉及一种增殖MSC的方法，包括在P物质存在下增殖MSC的步骤。
第八，本发明涉及一种愈合伤口或促进伤口愈合的方法，包括施用治疗有效量的P物质。
第九，本发明涉及一种愈合伤口或促进伤口愈合的方法，包括施用治疗有效量的MSC，其中通过P物质处理从骨髓中动员或增殖MSC。
本发明详细描述如下。
本发明人使用了碱灼伤角膜的动物模型，这个模型在检测伤口愈合过程中干细胞的全身性参与方面要优于其他创伤模型，这是由于角膜是透明并且是无血管的。
在观察到c-kit+细胞在角膜碱灼伤的兔子角膜和外周血中出现之后，使用RT-PCR分析和ELISA检测伤口微环境中细胞因子和其他因子的表达情况，以及角膜碱灼伤的小鼠外周血的情况。结果显示P物质是在角膜伤口和角膜碱灼伤的小鼠的外周血中表达增加的第一个神经肽。当时，P物质在角膜中首先升高并且稍后在外周血中升高。这显示P物质是由角膜常驻细胞，例如感觉神经元、上皮细胞、角膜细胞、和内皮细胞，而不是通过中性粒细胞或巨噬细胞的浸润提供的。血液中P物质浓度的提高可能来自P物质的全身扩散。并且，嗜中性粒细胞中缺乏P物质的免疫反应性，P物质的诱导和终止要比炎症阶段(直到创伤后第五天)更早，并且在创伤愈合的晚期阶段(创伤后7-10天)上皮细胞和成纤维细胞中的P物质染色很弱，支持了这样的假设，即P物质是由感觉神经元感受伤害的刺激而提供的。
随后，为了与伤口微环境中发现的其他因子分开单独确定P物质的全身效应，向无创伤的小鼠静脉注射P物质，检测CD29+MSC向外周血的动员。结果，观察到静脉注射了P物质的小鼠比没有注射的小鼠有大约15倍更多的CD29+MSC被动员到外周血中。在此认为，没有伤口的小鼠中MSC被动员到外周血中是因为在无伤口床情况下没有伤口位置供MSC来动员。
并且，为了检测P物质在MSC从骨髓的骨内膜表面动员中的作用机制，采用了体外细胞迁移分析，并且检测了P物质对MSC迁移、基质降解酶的动力学、细胞增殖和β-连环蛋白定位的作用。结果，显示在体外3D胶原凝胶中，P物质诱导了基质降解酶并抑制了它们的抑制剂，由此刺激了人MSC的迁移。这个结果进一步支持了P物质在MSC迁移中的作用。并且，发明人发现P物质刺激了细胞增殖和β-连环蛋白的细胞核转位作用，由此在MSC的动员之后促进了MSC的骨髓再增殖。
此外，本发明人基于对角膜透明度和视力恢复的评分，检验了静脉注射的MSC是否到达了受损组织并且参与了角膜的修复。结果，他们证实输入碱灼伤的兔子耳静脉的Di 1-标记的MSC成功供给到伤口床中并且提高了角膜的透明度和促进了视力恢复，由此促进了角膜伤口的愈合。
最后，本发明人基于肉眼检验、H&E染色、和免疫组化染色检验了P物质的静脉注射是否能促进角膜伤口的愈合。结果，与对照组(未注射P物质的组)相比较，注射了P物质的组角膜伤口的愈合进展迅速。
总之，发现在角膜伤口和外周血中P物质是最先增加的，并且促进了MSC向外周血的动员，以及促进了角膜伤口的愈合和骨髓中MSC的增殖。
因此，结论是P物质发挥了作为伤口信号启动者的作用，参与了MSC从骨髓到伤口位置的动员和补给。也确定了MSC动员到伤口位置并且参与了伤口愈合。
鉴于上述结果，MSC能够作为伤口愈合或促进伤口愈合的药物使用，或作为细胞生治疗药物使用。并且，P物质也能够用作为伤口愈合或促进伤口愈合的药物，或细胞性治疗药物，或MSC的动员、或增殖的药物、或促进其动员或增殖的药物。
在本发明中，P物质的有效剂量是0.1μg/kg至100μg/kg，MSC的有效剂量是3×104个细胞/kg至3×107个细胞/kg，特别是1×105个细胞/kg至1×107个细胞/kg。但是，这些剂量可依病人的体重、年龄、性别或伤口程度予以调整。
依照本发明的配方，可以通过肠道外或局部施用给人体，例如通过静脉注射、皮下注射、内皮注射、和肌肉注射。优选通过静脉注射给药。对于此目的，有效成分悬浮或溶解于药理学上可接受的载体，优选水溶性载体。
下面，通过下列实施例更为明确地阐述本发明，但是并不以任何方式有意限制本发明的范围。
实施例实施例1外周血中c-kit阳性干细胞的增加以及其在角膜碱灼伤后供给到伤口床中的鉴定重2-3kg的新西兰白兔购买自Samtako BioKorea。全部这些动物实验都经过韩国放射医学科学研究院伦理委员会(Ethical Committee，Korea Instituteof Radiological and Medical Sciences)和中央大学(CHUNG ANG UNIVERSITY)的认可，并且按照ARVO关于眼科和视觉研究中动物的使用声明(ARVO Statementfor the Use of Animal in Ophthalmic and Vision Research)进行。为了碱灼伤，将兔眼与吸收有1N NaOH的6mm圆形Whatman滤纸接触30秒。在碱灼伤后1、3、5、7、10和14天，分离兔眼和全血。将血涂片和角膜切片用抗-C kit抗体染色，该结果显示于图1中。
完整无损的角膜是无血管的组织，在此的广泛损伤可能需要血管提供炎性细胞和其他干细胞用于角膜修复。如图1中显示，当碱灼伤在兔角膜上完成后，外周血中的c-kit阳性细胞的数量较之正常对照有了增加，这种现象在碱灼伤后5天的角膜伤口床中也检测到了。这个结果确证了源自骨髓的干细胞可能活跃参与到了角膜的修复中。
实施例2P物质作为角膜碱灼伤引致的伤口信号启动者的作用的鉴定重30-40g的Balb/c小鼠购自Jackson Lab(West Grove，PA)。对于碱灼伤，将鼠眼与吸收有1N NaOH的3mm圆形Whatman滤纸接触10秒。在碱灼伤之后1、3、5、7、10和14天，分离鼠眼和全血。
组织损伤本身可能组成独特的伤口微环境引起例如炎症的全身性反应，以及诱导从骨髓动员干细胞以修复损伤组织。采用RT-PCR分析碱灼伤角膜的伤口微环境中保持这些功能的候选因子。
具体地，使用Trizol(Invitrogen)从碱灼伤的眼中分离RNA。使用反转录聚合酶试剂盒(Takara)对总量为1μg的RNA进行反转录(RT)，然后使用下述的小鼠基因特异性引物进行PCRVEGF(预期大小407)，(有义)5′GTACCTCCACCATGCCAAGT3′，(反义)5′AATGCTTTCTCCGCTCTGAA 3′，TNF-α(预期大小438)，(有义)5′GAACTGGCAGAAGAGGCACT3′，(反义)5′GTGGGTGAGGAGCACGTAGT3′，IL-1(预期大小432)，(有义)5′GCTGCTTCCAAACCTTTGAC3′，(反义)5′AGGCCACAGGTATTTTGTCG3′，P物质(预期大小309)，(有义)5′TCGATGCCAACGATGATCTA3′，(反义)5′AGTTCTGCATTGCGCTTCTT3′
图2a显示了PCR的结果。如图2a所示，发现角膜损伤后，眼中诱导出了P物质、IL-1、TNF-α和VEGF。
为了进一步监测这些因子的全身状况，以及评估其在干细胞从骨髓动员中的可能作用，对外周血进行了ELISA试验(R&D系统)。结果显示于图2b中。如图2b中所示，与无伤口状态相比较，血清中P物质的水平在第一天增加了大约3.2倍，3天时增加了大约4.4倍，5天时增加了大约1.3倍。但是，在碱灼伤后的第5天和第3天分别检出促炎症细胞因子TNF-α和IL-1的诱导，而从第7天时开始诱导出VEGF，比它们晚得多。
对于组织学检测，对角膜伤口床进行了苏木精和伊红(H&E)染色，并且用P物质抗体(Santa Cruz BiotechnologyCat#sc-9758，1200)进行免疫组化染色。小鼠的眼睛用4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)固定48小时。将石蜡包埋标本纵向切为4-μm切片，并转移到多聚-D-赖氨酸包被的玻片上。之后用苏木精和伊红(H&E)染色并进行组织学检验。对于P物质的免疫组化染色，用0.5％的H2O2孵育10分钟以封闭内源性过氧化物酶的活性。之后将组织用0.3％的Triton x-100透化处理5分钟，并且用一抗孵育，其余步骤按照厂商的说明书(ABC kit，Vector)进行，并且用固红复染细胞。
结果显示于图2c中。作为H&E染色的结果，炎性中性粒细胞最多持续5天，在第五天可以辨别迁移的上皮细胞，在第七天成纤维细胞的浸润显而易见，多数巨噬细胞在第14天已经消失。免疫反应性P物质在1天后的伤口床中被最为强烈地检测出来，并到第三天变弱。在第五天，P物质仅仅在成纤维细胞和迁移的上皮细胞中检测出来，但是在炎症细胞中未检测到，这暗示了早期的炎症细胞可能不分泌P物质。因此，角膜伤口本身似乎创造了一个富含P物质的微环境，这可能是角膜常驻细胞提供的，可能依次引起血清中P物质的升高。
为了确定来自骨髓的MSC是否被供给到伤口位置，用MSC的标记物-抗CD-29(Santa Cruz Biotechnology；Cat#sc-6622，1200)，抗c-kit(SantaCruz Biotechnology；Cat#sc-1493，1100)、和抗α-SM肌动蛋白抗体(Progen，Cat#61001，1200)进行免疫组化染色。该结果显示于图2d中。从图2d中可知，在炎症早期没有检测到表达CD-29、c-kit、和α-SM-肌动蛋白的成纤维细胞，直到第五天。从第七天到第十天，在伤口床处检测到它们，这与纤维组织形成期相符合，并且于14天后已经大部分消失从而符合重塑期。这个结果与伤口愈合的早期阶段伤口床处成纤维细胞的缺失与第七天伤口床处成纤维细胞首先出现相关联。由于只有一些成纤维细胞存在于正常的角膜基质中(Fig.2c)，并且常驻的成纤维细胞在7天之前的炎症期是缺失的，第7天伤口床处的CD-29，α-SM-肌动蛋白，和c-kit阳性细胞大概是从血液中输入的MSC。
实施例3通过静脉注射P物质将MSC从骨髓到动员到外周血中的鉴定对P物质进行检测来确定其是否是动员干细胞进入血流的原因，或是否是伤口微环境中的一些其他未确定因素与干细胞动员有关。
为了区分伤口微环境中其他因素的效应，向没有进行眼睛碱灼伤的Balb-c小鼠尾静脉中静脉注射P物质(0.1nmole/g体重)(Calbiochem)，1天之后收集全血。用percoll梯度离心去除红细胞之后，将粘附的细胞培养48小时以去除淋巴细胞，并且之后为了将MSC与淋巴细胞区分开，用CD-29(β1整联蛋白)的抗体来进行免疫染色，巨噬细胞中不表达CD-29。
结果显示于图3a和3b中。在1天之内，P物质的静脉注射强烈刺激了CD-29阳性MSC动员进入外周血，这比未注射的小鼠高大约15倍(图3b)。这显示了P物质的新作用，可能是在伤口愈合过程的早期阶段表现以动员MSC从骨髓进入全身血液，向角膜伤口部位供给MSC，并且促进角膜的修复。
实施例4鉴定P物质引起MMP活性的提升MSC坚固粘附于骨髓的骨内膜表面，为了确定在MSC的动员中P物质的机制，首先检测P物质来确定其是否刺激了人MSC的迁移，该MSC培养于3-D胶原凝胶的顶部。按照厂商的说明书(Nitta gelatin，Japan)，在12mm的插入式细胞培养皿(Millicell)的膜(微孔12-μm孔径)中制备出I型胶原凝胶基质，并且用IV型胶原(Nitta)包被过夜。将MSC铺板于胶原凝胶的顶部，并且外腔(outer chamber)用含有P物质的MSCGM(Cambrex Bio Science)充满。用相差显微镜(Olympus)监测胶原凝胶的清除。72小时的时候，插入式细胞培养皿的嵌入物和外部器皿固定并用苏木精染色，之后储存培养物上清液用于明胶酶谱分析法。该结果显示于图4a中。如图4a中所示，施加到底部皿的P物质以剂量依赖性方式刺激了胶原凝胶的降解和MSC的迁移。
使用培养物上清液进行白明胶酶谱分析法的检测。在8％的SDS-PAGE中，对培养液的上清进行电泳，这里添加的是不含巯基乙醇的样品缓冲液。凝胶用2.5％的Triton x-100进行复性以去除SDS，之后用显影缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.2 100mM NaCl，20mM CaCl2)孵育，于37℃下过夜，并且将凝胶用考马斯蓝染色。该结果显示于图4b中。如图4b所显示，培养基的明胶酶谱分析法显示了MSC迁移过程中MMP-9和MMP-2活性的强诱导。
通过培养基和使用35S-甲硫氨酸标记的MSC细胞裂解液的免疫沉淀反应检测P物质对于MMP(基质金属蛋白酶)及其抑制剂的生物合成的效果。MSC用P物质进行处理并且用50μCi/ml 35S-甲硫氨酸(Amersham)标记16小时。用裂解缓冲液(1％的NP40，10mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，2mMPMSF)制备细胞裂解液。对于分泌的MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的免疫沉淀反应，将培养液的上清与其特异性的抗体[抗MMP-1(chemicon；Cat#MAB3307，1100)、抗MMP-2(Chemicon；Cat#MAB13405，1200)、抗MMP-9(Calbiochem；Cat#444236，1100)、抗TIMP-1(Calbiochem；Cat#IM32L，1250)和抗TIMP-2(Calbiochem；Cat#IM11L，1250)]在恒定的转速下孵育2小时，并通过G蛋白琼脂糖4B(Biorad)收集抗体。沉淀用免疫沉淀反应缓冲液(150mM NaOH，50mM Tris-HCl pH 7.4，0.2％SDS和0.5％脱氧胆酸钠)洗涤3次，用高盐缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.4，0.5M NaCl)洗涤一次，用低盐缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.4)洗涤一次。SDS-PAGE之后，在2M水杨酸钠中浸泡凝胶，干燥，并暴光于X射线底片2周。对于MMP-9的免疫沉淀反应，将细胞裂解液与MMP-9抗体孵育，其余步骤与上面描述相同。该结果如图4c所示。
MMP-1、MMP-2、MMP-9、和MT1-MMP的生物合成受到剂量依赖的刺激。相比之下，其抑制剂TIMP-1和TIMP-2的生物合成受到P物质的抑制。
结果，P物质刺激了3D胶原凝胶中MSC的迁移、MMP的诱导、及其抑制剂TIMP的抑制。
实施例5P物质促进MSC再增殖的鉴定如果P物质仅有从骨髓中动员MSC的能力，动员之后骨髓基质中的MSC库可能变空。再次检测P物质对细胞增殖和自我更新能力的作用效果。
在用P物质处理3天后，进行台盼蓝排染活细胞计数。结果显示于图5a中。
P物质提高了活细胞的数目，与对照组相比，1nM时为1.7倍，10nM为2.1倍，100nM为2.2倍。
为了检测P物质是否影响人MSC自我更新的能力，检测wnt信号通路下游的效应子β-连环蛋白。将MSC(Cambrex Bio Science)以1×104/孔的密度铺板，并与MSCGM(Cambrex Bio Science)孵育。细胞粘附之后，用各个浓度的P物质处理细胞，孵育16小时和48小时。MSC用4％的多聚甲醛进行固定并且用0.3％的Triton X-100透化。用20％常规的山羊血清(血清在磷酸缓冲液中稀释)封闭非特异性抗原1小时之后，用针对β-连环蛋白的抗体(BDBiosciencs；Cat#6010153，1100)孵育盖片90分钟，之后用FITC偶连的二抗孵育60分钟(Vector)。细胞用DAPI复染，并用共聚焦显微镜(Leica)检验。这个结果显示于图5b。
用P物质处理以后16小时，主要在人MSC的细胞质中观察到了β-连环蛋白。但是只有用100nM的P物质处理的少量MSC显示出β-连环蛋白的核定位。但是P物质处理以后48小时，β-连环蛋白的核转位作用更为显著，特别是用100nM P物质处理过的所有MSC都显示出β-连环蛋白的核转位作用。
纤连蛋白和VEGF是Tcf/β-连环蛋白的下游基因，对二者进行了ELISA和Western印迹分析。这些结果显示在图5c和5d中。
如图5c和5d所显示，P物质诱导了VEGF和纤连蛋白。这证实了P物质在剩余MSC的再增殖中起了作用，这是通过众所周知的经典wnt信号通路刺激细胞增殖或自我更新获得的。
总之，P物质刺激了细胞增殖、β-连环蛋白的转位、和β-连环蛋白下游基因VEGF和纤连蛋白的诱导，所有这些都提示P物质在骨髓的再增殖中发挥作用。
实施例6鉴定I.V.注射的MSC向角膜伤口床的供给以及视力恢复的改善如图3所示，P物质的静脉注射足以刺激小鼠的CD-29+MSC动员进入外周血。为了检测动员的MSC是否能够真正参与角膜伤口的愈合，在角膜碱灼伤之后24小时，将Di 1-标记的MSC注入未经照射的兔子耳静脉中，以使MSC归巢至骨髓最小化，而使供给到伤口位置的MSC最大化。
从一月龄的异源兔子的胫骨中，通过骨髓灌洗和抽吸分离出MSC，并用MSCGM培养多至三代。通过c-kit、STRO-1、和α-平滑肌(SM)肌动蛋白的表达确定粘附的细胞是MSC，并且用于细胞输注实验。为了跟踪输注的MSC，胰蛋白酶消化的细胞与Di 1溶液[Celltracker CM-Di I(Cat#C-7000)；Molecular Probes]在37℃孵育5分钟以及在4℃孵育15分钟。标记之后用PBS洗涤三次，将MSC(1×106个细胞/ml)重悬于不含血清的新鲜培养液中，并在角膜碱灼伤之后1天注射进10只兔子的耳静脉。
在碱灼伤创伤后的第2周和第4周，用裂隙灯检查未注射组和MSC注射组(用Di I标记)的眼睛。该结果显示在图6a中。在MSC注射组中，角膜视力的恢复要好于未注射组。
用光-裂隙显微镜检查和照片材料(photo-documentation)检验上皮缺损的闭合来确定上皮愈合时间。按照下面的标准为角膜的不透明性评级；0级-无不透明性，1级-虹膜结构可见及轻度不透明性，2级-虹膜微细结构不可见，3级-仅看到虹膜为棕色，和4级-完全不透明。这个结果显示于表1中。
表1
*p＜0.05如表1中显示，注射了MSC的兔子上皮愈合的时间缩短了2倍，比未注射组的角膜透明度更好，角膜的新血管形成更少。
进行FLAT mount是为了确证输注的Di 1标记的MSC是否定位于伤口床。为了确定角膜中Di 1标记的MSC，用荧光立体显微镜(Leica)于1天、2周、和3个月时，检测FLAT mount。
该结果显示于图6b中。如图6b所示，在上皮水平和基质水平检测到Di 1-标记的MSC。早在静脉内输注后一天就在伤口床处检测到Di 1-标记的MSC，并且甚至在自输注3个月之后仍检测到其存在，尽管Di 1的密度较低。
实施例7通过P物质的静脉注射促进角膜伤口愈合的鉴定如图3所示，P物质的静脉注射足以促进小鼠的CD-29+MSC动员进入外周血中，并且如图6所示，P物质的静脉注射改善了角膜视力的恢复。因此，检测仅P物质是否能刺激角膜伤口的愈合。为了评估P物质静脉注射加速伤口愈合的效果，在灼伤后立即首先静脉注射剂量为6.5μg/kg的P物质，然后在灼伤后的第二天再次注射。在静脉注射之后7天，通过照数码相片来裸眼评估角膜的恢复。本结果显示于图7a中。如图7a所示，在注射了P物质的兔子中，角膜再生比没有注射的对照组快很多。如图中显示的角膜不透明的清除和出血区域的消失，与没有注射的对照组兔子相比，P物质的静脉注射强烈加速了角膜的愈合。
为了观察组织学水平上的伤口愈合程度，分离出兔眼并且固定，之后，H&E染色并且针对CD29进行免疫染色。H&E的染色结果显示于图7b中。如图7b所示，注射P物质的组显示有完全厚度的上皮覆盖、组织良好的血管结构、和致密胶原束的有序排列，除了上皮下仍有巨噬细胞和多形核巨大细胞存在外，这些与未损伤的平行侧的相类似。相反的，未注射的兔子在同一天仅仅显示出上皮细胞稀疏的覆盖，大的成纤维细胞样细胞的活跃浸润、和基质内松散无组织的胶原小纤维，这些与P物质注射组第五天观察到的相似。
CD29染色的结果显示在图7c中。如图7c所示，未注射组显示未分化的间充质干细胞(表达CD29的细胞)，但是，注射了P物质的组显示了处于胶原蛋白纤维之间的小的纺锤形状CD29+细胞，这与正常的角膜基质相似。因此，在整个时期中，比较在注射了P物质和未注射的角膜之间的组织学观察，确证了SP IV的注射加速了愈合的速率，这比对照组要快。这些结果意味着P物质的注射对于角膜伤口的愈合是有效的。
根据本发明，P物质最初在碱灼伤的角膜中增加，并且通过血液移动进入骨髓，之后刺激骨髓中的间充质干细胞，并且诱导骨髓中MSC的再增殖。
因此，P物质能够作为伤口愈合或促进伤口愈合的药物、动员或增殖MSC、或促进MSC动员或增殖的药物使用。
并且，证实了MSC直接参与伤口愈合。因此，MSC能够被作为伤口愈合或促进伤口愈合的药物使用，或作为细胞性治疗剂使用。
权利要求
1.P物质制造用于从骨髓动员或增殖间充质干细胞(MSC)，或促进所述动员或增殖的药物的用途。
2.P物质制造用于伤口愈合或促进伤口愈合的药物的用途。
3.权利要求1或2的用途，其中所述药物包括MSC。
4.权利要求3的用途，其中所述药物是细胞性治疗剂。
5.一种用于从骨髓动员或增殖MSC，或促进所述动员或增殖的制剂，其含有P物质作为有效成分。
6.一种伤口愈合或促进伤口愈合的制剂，其含有P物质作为有效成分。
7.一种伤口愈合或促进伤口愈合的制剂，其含有MSC作为有效成分，其中，通过P物质的处理来从骨髓动员或增殖MSC。
8.一种分离MSC的方法，包括通过P物质处理从骨髓中动员MSC的步骤。
9.一种增殖MSC的方法，包括在有P物质存在下增殖MSC的步骤。
10.一种愈合伤口或促进伤口愈合的方法，包括施用治疗有效量的P物质。
11.一种愈合伤口或促进伤口愈合的方法，包括施用治疗有效量的MSC，其中通过P物质处理从骨髓动员或增殖MSC。
全文摘要
本发明涉及利用P物质制造用于从骨髓动员或增殖间充质干细胞(MSC)，或促进上述动员或增殖的药物的用途，以及利用P物质制造用于伤口愈合或促进伤口愈合的药物的用途。
文档编号A61K45/00GK1824289SQ20051013802
公开日2006年8月30日 申请日期2005年10月27日 优先权日2004年10月27日
发明者孙英淑, 洪贤淑, 金在灿 申请人:韩国原子力研究所, 中央大学校算学协力团