专利名称：二氧化硅纳米颗粒及其用于疫苗接种的用途的制作方法
二氧化硅纳米颗粒及其用于疫苗接种的用途本发明涉及由二氧化硅构成的超小型、单分散的纳米颗粒，在其表面固定有至少 一种抗原。该纳米颗粒可以用于癌症的免疫预防或免疫治疗。本发明的主题还在于将抗原 靶向到抗原呈递细胞并用于活化免疫系统的方法，其中通过颗粒特性调节靶向和/或免疫 活化的效率。本发明还涉及用于哺乳动物的主动和被动免疫的方法。动物或人类有机体的健康尤其取决于，有机体以何种程度能够自我防护源于周围 环境的致病因素或者有机体以何种程度能够识别和清除改变的自体材料。满足这些功能的 人体或动物体的免疫系统能够分为两个功能范围先天性的和获得性的免疫系统。先天性 免疫力是针对感染的第一道防线，并且在病原体例如造成可识别的感染前，使大多数潜在 的病原体变得无害。获得性免疫系统对被称为抗原的侵入的有机体或改变的自体材料的表 面结构做出反应。有两种类型的获得性免疫反应体液免疫反应和细胞介导的免疫反应。在体液免 疫反应中，在体液中的已有抗体与抗原结合并导致其失活。在细胞介导的免疫反应中，T细 胞能够主动破坏其它细胞。例如当在细胞中存在与疾病相关的蛋白时，它们在细胞内部被 片段化地蛋白水解成肽。然后特异性细胞蛋白结合到如此产生的蛋白或抗原的片段上并将 其转运到细胞表面，在该处它们被呈递到分子的防御机制，尤其是机体的T细胞。将肽转运到细胞表面并在该处呈现的分子被称为主要组织相容性复合物(MHC) 蛋白。MHC蛋白的意义还在于，其允许T细胞将自身抗原区别于非自身抗原。例如在使用肽 疫苗的情况下，此类非自身肽序列的识别使得操纵免疫系统对抗患病细胞成为可能。在疫苗领域中用于呈递蛋白源抗原或肽抗原的技术必须满足两个基本任务将抗 原有效地转运到树突状细胞和树突状细胞随后活化以产生获得性免疫应答。目前的疫苗发 展关注于分子策略，其针对例如在皮肤或肌肉中作为靶的外周树突状细胞。特别地，通过抗 体(该抗体对树突状细胞的细胞表面受体是特异性的，并且，或者与抗原融合，或者在颗粒 表面聚集)，将抗原指引到其树突细胞的特定部位。此类高要求的细胞特异性靶向的构建不 是强制性的，尤其如Fifis等人，(2004) J Immunol. 173 (5)，3148所能指出的，其通过将与 银缀合的聚苯乙烯小球转运到树突状细胞产生免疫应答。此外，在免疫学中已知的是，使用佐剂以便非特异性提高针对所给物质的免疫应 答。在抗原产生特异性免疫应答期间，基本上是佐剂负责该应答的强度。为了产生获得性免 疫应答，使用佐剂诱导树突状细胞成熟是不可缺少的。在此，树突状细胞成熟是分子危险信 号的结果，所述分子危险信号通过先天性免疫的信号通路产生，例如，Toll样受体(TLRs) 或炎性细胞因子受体。例如WO 2004/108072A2中描述了一种缀合物，其中将免疫应答修饰 的化合物，例如TLR激动剂，连接在金属颗粒载体上，该载体还具有至少一种活性物质。免 疫应答修饰的化合物在此理解为疫苗的佐剂，其虽然引起细胞毒性淋巴细胞强烈活化，但 却使颗粒构建及其经济制备变得复杂和随之产生增高的毒性风险和生理学上的运输限制。WO 2001/12221A1描述了与蛋白原性抗原、细胞或细胞碎片结合的二氧化硅的固 有佐剂效应，该效应基于粗糙的棱角和不规则的形态，因此允许细胞膜的穿透和表面蛋白 的修饰。与此相反，WO 2007/030901A1 和 Vallhov 等人，(2007), Nano Lett. 7 (12), 3576
5将佐剂效应与二氧化硅颗粒的中孔度( MesoporositSt)相关联。独立于基本原因，EP 0465081B1已教导了一种制剂，其包含由金属、陶瓷(例如二氧化硅)或聚合物组成的核心 部分、至少部分覆盖该核心部分表面的包衣(该包衣包括基糖、改性的糖或寡核苷酸)，和 与被包覆的核心部分保持接触的至少一种病毒蛋白或肽。核心部分具有10-200nm的直径， 但也可凝集成更大的颗粒，这甚至是可以期望的，因为由此出现储藏效应(D印otwirkimg)。 不利的是，通过这种凝集不能产生药学上稳定的悬浮液，也不能提供可无菌过滤性。本发明的任务在于克服现有技术中出现的缺点并开发纳米颗粒，该纳米颗粒具有 单分散的粒径并使在免疫预防或免疫治疗上的有效应用成为可能，特别是作为疫苗，其在 降低副作用的同时，改善治疗的有效性。本发明任务根据独立权利要求得以解决。从属权利要求包含优选的具体实施方 式。根据本发明，提供包含基质的纳米颗粒，该基质包含超过50%的二氧化硅，其中该二氧 化硅具有至少一种表面官能团，在该表面官能团上固定有至少一种抗原，并且其中纳米颗 粒具有5-50nm的粒径。在此，如此解释粒径，在整个5-50nm的范围内不存在随机分布，而 是在上述范围内选择预定的粒径，其标准偏差最大为15%，优选最大为10%。在本发明的 一个具体实施方式
中，颗粒的粒径为10-30nm，优选20-30nm，特别优选1319nm，完全特别 优选 25nm士 10%。令人惊奇地显示，通过在5-50nm的狭窄粒径范围内提供二氧化硅纳米颗粒，抗原 靶向到抗原呈递细胞的效率可以明显提高。特别是，不再靶向浅表外周的树突状细胞，而是 靶向淋巴结中的那些树突状细胞。依据其粒径和材料选择如此构造根据本发明的纳米颗 粒，使得树突状细胞的成熟被高效诱导。该诱导特别在补体系统活化下发生。鉴于靶向到 具有高树突状细胞密度的淋巴结和鉴于作为T细胞增生和免疫的前提条件的树突状细胞 成熟的途径，根据本发明的二氧化硅纳米颗粒由此展现了全新的可能性。值得注意的是，出 现了基于该纳米颗粒的疫苗，该疫苗在免疫接种中无需常规不可缺少的佐剂。目前，仅由US 6，086，881可知，疫苗材料应具有大的分子量，这提高针对抗原决 定簇的概率。同样期望的是，将疫苗材料聚集到或吸附到明矾或其它凝胶上，因为细胞表面 分子的细胞连接和刺激会通常变得更有效，以及由于缓慢的解吸附速率，抗原在较长的时 间间隔中保留在组织中。这也通过Vallhov等人，(2007), Nano Lett. 7 (12)，3576，证实， 由中孔二氧化硅构成的较大颗粒对由单核细胞衍生的人树突状细胞具有较大影响。此外， 在本领域中根据WO 2008/019366A2描述了用于靶向抗原呈递细胞的抗原-二氧化硅-缀 合物，对于该缀合物，0. 3-20 μ m的粒径被视为是对于吞噬作用所必须的前提条件。与此相 反，本发明揭示了，恰恰是二氧化硅纳米颗粒以所定义的5-50nm的狭窄粒径范围能够用于 被动靶向到抗原呈递细胞和用于补体活化。在本发明的意义中，“抗原呈递细胞”理解为可以诱导将抗原呈递到T细胞的各种 细胞，其中也包括前体细胞，其可以分化成抗原呈递细胞并可以活化。抗原呈递细胞包括树 突状细胞、朗格汉氏细胞、PBMCs、巨噬细胞、B-淋巴细胞或其它活化或修饰的细胞类型，如 上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞，MHC分子在其细胞表面表达，优选树突状细胞，特别优选 淋巴结的树突状细胞。抗原呈递细胞的前体包括CD34+细胞、单核细胞、成纤维细胞和内皮 细胞。根据本发明，颗粒状的连接基质包含大于50%的二氧化硅。连接基质也可以和其它组分混合，其中在多组分体系中二氧化硅显示最高的组分。对于其它组分的实例是金属、 金属衍生物、金属氧化物、聚合物、有机硅烷、其它陶瓷或玻璃。然而，在本发明的一个实施 方案中，作为其它组分，排除聚合物。优选的是，所述基质包含直至至少80 %的二氧化硅，特 别优选至少90%。在本发明的一个完全特别优选的具体实施方式
中，纳米颗粒包含基本上 是纯的二氧化硅基质，即其仅具有制备方法过程中预期的杂质。在本发明最优选的具体实 施方式中，颗粒状的连接基质由二氧化硅组成。为了制备颗粒尤其还提供了经典的Stdber合成，其中通过在水-醇-氨碱 性介质中水解四乙氧基硅烷(TEOS)，可以制备预定粒径的单分散的、纳米级二氧化硅 (J. Colloid Interface Sci. 1968,26,62) 发明人可以令人惊奇地显示，尽管表面官能化， 但纳米颗粒的稳定性仍然保留，由此获得不倾向于聚集的单分散颗粒。根据本发明因此优 选纳米颗粒，其根据具有以下步骤的方法制备(a)在含有水、至少一种增溶剂和至少一种胺或氨的介质中水解缩聚四烷氧基硅 烷和/或有机三烷氧基硅烷，其中首先产生初级粒子的溶胶，并随即通过连续地、按照终止 反应措施地控制地计量加入相应的硅烷阻止进一步成核，使获得的纳米颗粒达到在5-50nm 范围内的所期望的粒径，和(b)将抗原固定在所述纳米颗粒的表面官能团上。如果氨是介质的成分，则特别使用醇作为增溶剂，从而在水-醇-氨介质中进行反 应，就此获得高分散的颗粒，其平均粒径的标准误差不超过10%。目前发明人意外地发现， 采用这种方法甚至实现具有所期望的单分散特性在50nm以下的粒径。该方法的步骤(a) 已描述于EP0216278B1和WO 2005/085135A1中，因此这些文献以其整体被引入本申请公开 中作为参考。优选在介质中使用至少一种胺。根据本发明的纳米颗粒的二氧化硅基质既可以是有孔的也可以是无孔的。孔度 基本上取决于制备方法。参见根据EP 0216278B1的合成特别得到无孔的颗粒。在5-50nm 的起始范围内，对于无孔纳米颗粒优选的粒径为10-30nm，而对于有孔颗粒优选的粒径为 10-40nm。本发明的优选颗粒是固体。在本发明中，“纳米颗粒”被理解为在其表面上具有官能团的颗粒状的连接基质， 其对于最终待连接的或待吸附的抗原作用为识别部位。所述表面在此包括所有的面，即除 了外表面外，还有颗粒中空腔(孔)的内面。在根据本发明的实施方案中抗原因此可以收 纳于颗粒中，这以二氧化硅基质的孔度为先决条件。表面官能团可以不仅由一种或多种化学基团组成，其可以是相同的或不同的，其 中所述基团或者以其特性作为接头允许纳米颗粒与抗原的特异性固定，或者形成用以固定 的非特异性的ζ电势(Zetapotential)。术语“固定”此处是指在表面官能团和抗原之间的各种类型的相互作用，特别是 共价或非共价连接，如共价连接、疏水/亲水相互作用、范德华力、离子键、氢键、配体-受 体-相互作用、核酸的碱基配对或者表位和抗体结合位点间的相互作用。在本发明优选的具体实施方式
中，抗原与纳米颗粒共价连接。共价连接可以直接 或间接进行。在直接的变化形式中，将抗原直接缀合到颗粒上的化学基团上，这大多以位 点非特异性的方式发生，并可使在抗原呈递细胞的吞噬体中的随后释放变得困难。在本发 明的实施方案中期望的是，排除硫醚、碳水化合物和/或寡核苷酸作为表面官能团。共价
7连接的非直接方法使用接头或标记，通过其将抗原位点特异性地连接到颗粒上，并受控地 再次释放。位点特异性缀合的标记在本领域是已知的，如SNAP-标记、Halo-标记、C-末端 LPXTG-标记、生物素-受体-肽、PCP或ybbR-标记，并且尤其描述于WO 2008/019366A2中， 使得这些文献以其整体被引入到本发明的公开内容中作为参考。该参考也适用在本申请文 献中所有关于这些文献的进一步提及。在表面官能团的优选的具体实施方式
中，其通过不稳定的接头呈现，特别优选通 过腙接头、二硫化物接头或酶易接近的肽序列。在第一临床候选物中，多柔比星经酸不稳定 的腙连接作为预期断裂点与聚合物连接(Angew. Chem. 2006，118，1218)。所述大分子通过细 胞内吞作用被摄入到细胞中，在该过程中PH值由在胞外间隙中的生理值(pH 7.2-7.4)明 显下降到胞内体中的PH 6. 5-6和在初级和次级溶酶体中的pH 4。pH值由于细胞摄取降到 6以下，腙连接断裂，并且活性物质从聚合物载体上脱落。对本领域技术人员而言，其它适于 本发明的可裂解的接头是已知的，并在下文的说明中描述。在另一优选的表面官能团的具体实施方式
中，其选自烷氧基硅烷基团。在此，特别 优选末端反应性硫醇基团。烷氧基硅烷可用于固定抗原和其它官能团的其它配体，其中用 稳定的接头固定后者是优选的。用于本发明纳米颗粒目的的合适的烷氧基硅烷可由本领域 技术人员按常规的方式选择。在本发明的另一实施方案中，抗原被吸附到纳米颗粒上。吸附例如可以通过将抗 原与颗粒在固定的时间段内进行混合，然后将纳米颗粒从混合物中分离，如通过离心或过 滤。电荷甚至可以在颗粒合成期间出现。在本发明的意中在此可以理解，吸附也需要合适 的表面官能团(Z电势)，其或者可以是基质的固有成分，或者要不然是施加的。如果表面取决于所选合成路径还不具有官能化，则在将抗原固定前将其施加。当 通过水解缩聚根据上述方法步骤(a)制备纳米颗粒时，在步骤(a)之后且在步骤(b)之前 进行表面的官能化。在颗粒壳上的许多硅原子带有羟基官能团，其按标准方法能与多个 商业可获得的三烷氧基硅烷或三氯硅烷反应，从而使颗粒以简单的方式进行各种官能化 (J. Liq. Chrom. &rel. Technol. 1996，19，2723)。如果所追求的应用或所希望的性质对纳米 级二氧化硅颗粒要求更高的化学复杂性，则使用改进的多步合成。通过与表面官能团的相互作用，最终在纳米颗粒上固定抗原。“抗原”在此被理解为一种结构，其能够产生细胞或动物的免疫应答。可理解的是， 免疫应答包含在所有哺乳动物中的一种动物(特别是人类)内。抗原优选是蛋白原，即涉 及蛋白质、多肽、肽或其片段，它们又可以是任意大小、来源和分子量以及糖基化的，但含有 至少一个抗原决定簇或抗原表位。通过免疫系统的识别特别是从3个氨基酸的至少长度进 行。蛋白质或肽优选自下组细胞因子、受体、外源凝集素、亲和素、脂蛋白、糖蛋白、寡肽、 肽-配体和肽-激素。抗原也可是核酸本身或由核酸编码，其在转运到抗原呈递细胞的核 内后被翻译成蛋白源性抗原，该抗原被呈递到MHC-分子上。核酸是单链或双链DNA或RNA 以及寡核苷酸。核酸也可是复合物或配制剂的成分，其由脂质、糖类、蛋白或肽组成。其它 抗原是多糖、聚合物、分子量为50-1000Da的低分子量物质、病毒、完整的原核或真核细胞 或细胞碎片。在本发明的具体实施方式
中，抗原具有小于500kDa的分子量。抗原优选癌症抗 原。此类癌症抗原优选是在WO 2008/019366A2中公开的。在本发明特别优选的具体实施方式
中，癌症抗原选自下组NewYork Esophageal 1 抗原(NY-ESO-I)、MAGE-AU MAGE-A2、 MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-AlO、MAGE-B、MAGE-Cl、MAGE-C2、L 抗原(LAGE)、 SSX2、SSX4、SSX5、PRAME, Melan-A、半胱天冬酶 _8、酪氨酸酶、MAGF, PSA、CEA、HER2/neu、 MUC-l、MARTl、BCR-abl、p53、ras、myc、RB-l和生存素或其表位。在本发明完全特别优选的具 体实施方式中，所述癌症抗原是生存素或其表位。这些癌症抗原描述于WO 2007/039192A2 中，因此这些文献以其整体被引入本申请公开中作为参考。在本发明的另一实施方案中，排除作为表面官能团和抗原的受体和/或MHC分子。该纳米颗粒可以是多官能化的，这在本发明中表示各种化学基团(表面官能团) 和/或各种连接分子(官能基团)。优选的是，表面官能团和连接的官能基团都是不同的， 由此提供官能分子的特异性的、独立的连接。所述官能基团优选自下组抗原、聚乙二醇 (PEG)、标记和佐剂，其中可理解，总是选择抗原。特别优选有抗原和PEG和/或佐剂，完全 特别优选抗原、PEG和佐剂，其中这些官能基团可以是吸附和/或共价连接的。在根据本发明颗粒的实施方案中，通过发光、UV/VIS-着色、酶促、电化学或放射 性检测标记。优选使用荧光染料或放射性标记。在光致发光或荧光下，通过吸附光子进行 激发。优选的荧光基团是双苯并咪唑(Bisbenzimidalole)、荧光黄、吖啶橙、Cy5、Cy3或碘 化丙锭(Propidiumiodid)。用视觉或用相应的检测仪进行评估，如在荧光显微镜中或通过 流量细胞计数，如在细胞荧光计中。在本发明特别优选的实施方案中，将荧光染料连接到 3-氨丙基三乙氧基硅烷上，其中异硫氰酸荧光素是完全特别优选的荧光染料。可选地，还可以用放射性同位素进行放射性检测，优选用3H、14C、32P、33P、35S、99mTc、 力11或1251，特别优选用99mTc或mIn。特别地，通过点击化学(Klick-Chemie)连接到纳米 颗粒上的1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N'，N"，N"‘-四乙酸(DOTA)或二乙烯三胺五 乙酸(DTPA)的衍生物直接在注射前用特别优选的放射性同位素标记(belegt)。在闪烁计 数中，例如通过放射活性的Y射线激发分子混合物。在跃迁到基态时作为光释放的能量将 通过光电子倍增器增强并计数。由此，根据本发明的纳米颗粒也具有作为诊断工具(如在成像方法中)和/或研 究工具的意义，该工具使靶向和活性物质摄取的可视化成为可能。在本发明的的另一实施方案中，将抗原如此与标记组合，使得可以在颗粒部分 (Partikelfraktion)内通过标记进行抗原分类。这意味着，第一颗粒或多个第一颗粒设置 有第一抗原和第一标记，而第二颗粒或多个第二颗粒设置有第二抗原和第二标记，等等，其 中抗原和标记彼此之间是各不相同的。抗原和标记的所述特异性组合因此是独一无二的且 是优选的，并使颗粒与不同抗原的混合以及靶向效率和/或免疫活化/补体活化的平行追 踪成为可能。与连续给药相反，在诊断中由此导致节省时间。当然同样可能的是，所述颗粒 带有强度变化的多个抗原和多个标记，从而可以从混合物中锁定特定抗原。标记优选特别 是与硅烷相连的荧光染料。本发明的纳米颗粒此外可以作为抗原和危险信号(如TLRs或细胞因子)的组合 物而被施用。在本发明另一实施方案中，将表面如此多官能化，使得排除多官能团交联。本发明的前述教导及其涉及将抗原固定到纳米颗粒上的表面官能团的具体实施 方式是有效的，且不限于可用在多官能团上和/或可用于将其它官能团固定在所述纳米颗粒上，只要这看起来是有意义的。用于构建高度复杂系统的普遍策略是由K. B. Sharpless (Angew. Chem. Int. Ed. 2001,40,2004)介绍的点击化学理念。然而其与其说是科学规律，不如说是合成哲学，其 尤其是在天然发生的反应中的简单性和效率所启发的。作为点击化学的典型实例是叠氮化 物和末端炔烃按照Huisgen的1，3_双极环加成。在一价铜的存在下，在非常高的产率和在 官能基团的大的带宽的容忍度下，该反应极其迅速地开始，此外区域选择性地进行。另一优 点在于在水性介质中和在室温下进行该合成的可能性，使得能够以模块设计原理的方式将 感兴趣的生物分子与其它构件模块化地并且广泛可用地连接。因此在本发明中优选的是， 在使用点击化学下，将相应的官能化的二氧化硅颗粒与上述的官能团，特别是抗原连接。本发明的主题还在于含有根据本发明纳米颗粒的分散体。该纳米颗粒可以在任 意溶剂中分散，只要通过该溶剂的纳米颗粒既不受到化学侵蚀也不发生物理改变并反之亦 然，从而所获得的纳米分散体是稳定的，特别在药学上和物理学上是稳定的。该分散体的特 别之处在于，该纳米颗粒是单分散的并且是不聚集的以及不倾向于沉淀，这导致可无菌过 滤性。本发明的前述教导及其涉及纳米颗粒的具体实施方式
是有效的，且不限于可用在分 散体上，只要这看起来是有意义的。本发明也可实际用作试剂盒，该试剂盒含有根据本发明的纳米颗粒和/或其分散 体。本发明的试剂盒也可包含含有书面说明的物品或指引用户到书面说明的物品，该说明 阐明与本发明纳米颗粒的关系。本发明的前述教导及其涉及纳米颗粒及其分散体的具体实 施方式是有效的，且不限于可用在试剂盒上，只要这看起来是有意义的。本发明的主题还在于含有根据本发明纳米颗粒或其分散体的药物制剂。此处“药 物制剂”是可以在预防、治疗、随访或患者康复(Nachbehandlimg)中使用的各种制剂，其至 少有时显示患者机体的整体状态的或单个部分状态的病理改变，特别是由于传染病、脓毒 性休克、肿瘤、癌症、自身免疫性疾病、过敏和慢性或急性炎症过程。因此特别可能的是，本 发明中药物制剂是疫苗和/或免疫治疗剂(Immuntherapeutikum)。该药物制剂可以含有抗 原，如肽或核酸，例如作为药学可接受的盐。此处尤其涉及无机酸如磷酸的盐，或有机酸的
Τττ . ο为了促进药物作用，即特别是免疫应答，在本发明具体实施方式
中药物制剂还包 含其它活性物质，其中同时或彼此相继给药是可想象的。那么，根据本发明药物制剂的治疗 作用可以例如在于，作为某些抗肿瘤药物所期望的副作用更好地影响补体系统的活化，或 通过减少剂量而降低该药物的副作用的量。在本发明优选的具体实施方式
中，将根据本发明的药物制剂与选自下组的化疗剂 组合细胞因子、趋化因子、前细胞凋亡剂、干扰素、放射性化合物或其组合物。优选的是，化 疗改变了核酸代谢和/或蛋白代谢、细胞分裂、DNA复制、嘌呤生物合成、嘧啶生物合成和/ 或氨基酸生物生物合成、基因表达、mRNA-加工、蛋白合成、凋亡或其组合，特别是减弱。为了激发自体的抵抗力或增强免疫系统，在本发明另一具体实施方式
中，与本发 明的药物制剂一起还加入免疫刺激剂，例如干扰素，例如IFN-α、IFN-β或IFN-γ、白介 素,例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10 或 IL-12、肿瘤坏死 因子，例如TNF-α或TNF-β、红细胞生成素、M_CSF、G-CSF、GM_CSF、CD2或ICAM。采用这种 方式，可以刺激如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细
10胞、巨核细胞和/或粒细胞的增生、发展、分化或活化。为了提高根据本发明的免疫原性纳米颗粒的保护或治疗效果，可以在由该纳米颗 粒制备的颗粒或所有药物制剂中添加药学上相容的佐剂。在本发明中，使与根据本发明抗 原的作用成为可能、增强或改变的每种物质都是“佐剂”。已知的佐剂例如是铝化合物，例如 氢氧化铝或磷酸铝；皂素，如QS 21 ；胞壁酰二肽或胞壁酰三肽；蛋白，如Y-干扰素或TNF ； MF 59、磷酸卵磷脂(Phosphatdibylcholine)、角鲨烯或多元醇。同样，在完全弗氏佐剂中 与鸡蛋-白蛋白联用使细胞介导的免疫力提高，并由此促进所形成的中和抗体的作用。此 外，具有免疫刺激剂性质的DNA或编码具有佐剂效果的蛋白，如细胞因子，可以平行地或在 构建体中施用。然而，由于基于二氧化硅的根据本发明的纳米颗粒的固有佐剂效应，目前优 选的是不使用其它佐剂。如果固有的佐剂效应在某些应用中被证明是不足够的，则当然可 以额外地在纳米颗粒上固定一种或多种佐剂，优选仅一种佐剂。固定的类型可以是吸附的 也可以共价键构成。本发明优选的待吸附连接的佐剂包括Poloxamere和TLRs。本发明优 选的共价连接的佐剂包括短链肽，特别优选促吞噬肽或卵清蛋白。根据本发明，可以以任何方式和方法将药物制剂引入各有机体细胞中，这使得抗 原呈递细胞与制剂中所含的纳米颗粒或抗原的接触以及通过吞噬作用摄入到细胞中成为 可能，由此诱导免疫应答。根据本发明的药物制剂可以口服、经皮、经粘膜、经尿道、阴道、直 肠、肺、肠内和/或肠胃外施用。优选肠胃外施用药物制剂。目前可显示，二氧化硅在其性 质上作为佐剂没有如对于聚合物佐剂所观察的那样对脂类代谢有负面影响(因此对于这 种聚合物佐剂给药方式不能够许可)。特别优选的是直接注射给机体。视指征、待给药的剂 量、个体特异性参数等确定所选的给药方式。特别地，给药的各种方式使位点特异性治疗、 副作用减少和活性物质剂量降低成为可能。完全特别优选的注射是皮内、皮下、肌内或静脉 内注射。给药例如可以借助于所谓的接种枪(Impfpistolen)或通过注射器进行。还可能 的是，将物质作为气雾剂提供，该气雾剂被有机体，优选人类患者吸入。药物制剂的施用形式(Darreichungsformen)采用常规的固体或液体载体物质和 /或稀释剂和常规使用的相应于所期望的给药类型的辅料以合适的剂量和已知的方法制 备。原则上药学可接受的和业内已知的赋形剂构成根据本发明药物组合物的一部分，其中 为了制备单独剂量(Einzeldosierimg)，与活性物质组合的赋形剂的量以取决于待治疗的 个体和给药的类型的方式变化。该药学上相容的添加剂包括盐、缓冲液、填料、稳定剂、螯 合剂、抗氧化剂、溶剂、粘结剂、润滑剂、片剂包衣、调味品、染料、防腐剂、标准化剂及其类似 物。用于此类赋形剂的实例是水、植物油、苄醇、亚烷基二醇、聚乙二醇、甘油三酯、明胶、糖 (如乳糖或淀粉)、硬脂酸镁、滑石粉和凡士林。药物配制剂可以以片剂、膜衣片剂、包衣片剂、吮吸片剂、胶囊剂、丸剂(Pille)、 粉剂、粒剂、糖浆、液剂、滴剂、溶液、分散体、混悬剂、栓剂、乳剂、植入剂、霜剂、凝胶剂、软膏
齐U、糊齐 、洗齐 、浆液、油、喷雾齐 、气雾齐 、粘合齐 、膏药或绷带的形式存在，其中优选分散 体。作为口服施用形式优选制成片剂、膜衣片剂、包衣片剂、吮吸片剂、胶囊剂、丸齐U、 粉剂、粒剂、糖浆、液剂、滴剂、溶液、分散体、混悬剂(也作为贮存形式)。作为片剂的药物形 式例如可以通过混合活性物质与已知的辅料来获得，所述辅料如葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘 露醇、聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，如玉米淀粉或藻酸；粘结剂，如淀粉或明胶；润滑剂，如硬脂酸镁或滑石粉，和/或可以实现贮存效果的物质，如羧基聚亚甲基、羧甲基纤维素、乙酸 邻苯二甲酸纤维素或聚乙酸乙烯酯。该片剂也可由多个层组成。同样，糖衣丸能够采用常 规在糖衣丸包衣中使用的药剂，如聚乙烯吡咯烷酮或虫漆、阿拉伯胶、滑石粉、二氧化钛或 糖通过类似于片剂将所制备的芯包衣来获得。包衣片剂壳在此也可由多个层组成，其中例 如使用上述的辅料。胶囊可以通过使活性物质与载体，如乳糖或山梨醇混合，然后包入到胶 囊中来制备。药物制剂的溶液或分散体可以与物质，如糖精、人造糖精、糖类和/或与香料， 如香草醛或橙子提取物混合以改善味道。此外，其可以与悬浮辅料如羧甲基纤维素钠，或防 腐剂如羟基苯甲酸、苯酚、苄醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯苄烷铵 或氯苄乙铵混合。此外，肠胃外药物形式，如栓剂、混悬液、乳液、植入剂或溶液是可考虑的，优选含 油溶液或水溶液。为了肠胃外给药，可将本发明的免疫原构建体溶解或悬浮于生理学相容 的稀释剂中，如中性脂肪或聚乙二醇或其衍生物。作为优选的溶剂，通常使用具有或不添加 增溶剂、表面活性剂、助悬剂或乳化剂的油。所用油的实例是橄榄油、花生油、棉籽油、蓖麻 油抗和芝麻油。为了局部施用药物制剂，将其与至少一种药学上可接受的载体，如微晶纤维素和 任选的其它辅料(如润湿剂)以常规的方式配制成在皮肤上施加的固体配制剂，如霜剂、凝 胶剂、软膏剂、糊剂、粉剂或乳液，或配制成在皮肤上施加的液体配制剂，如溶液、混悬剂、洗 剂、浆液(Seren)、油、喷雾剂或气雾剂。实例是在醇溶液，如乙醇或异丙醇、乙腈、DMF、二甲 基乙酰胺、1，2-丙二醇或其彼此的混合物和/或与水的混合物。脂质体也可用作该药物制 剂的载体系统，其确保最佳地运输到皮肤中。作为局部施用的制剂也可考虑经皮系统，如 溶液、混悬剂、霜剂、软膏剂、粉剂、凝胶、乳液、粘合剂、膏药或绷带，其含有纳米颗粒以及载 体。有用的载体可以含有可吸收的、药学上合适的溶剂，以便促进纳米颗粒穿过皮肤。能确 保良好渗入皮肤的溶剂例如是醇，苯基乙醇-1、甘油、乙醇或其混合物。药物制剂优选以注射液的形式存在。为了制备注射液，可以使用水性介质，如蒸馏 水或生理盐水，其中后者包括酸加成盐和碱加成盐。药物制剂也可以以固体组合物的形式， 例如以冻干状态的形式存在，并然后通过添加溶解剂，如蒸馏水，在使用前准备好。制备冻 干剂的原理对技术人员来说是熟知的。在配制剂中活性纳米颗粒的浓度可以介于0. 1至100重量百分含量变化。重要的 是，作为活性物质的药物组合物包含有效量的纳米颗粒和/或其分散体以及药学上可接受 的辅料。术语“有效量”或“有效剂量”此处可以互换使用，并表示对疾病或生理学改变具 有预防或治疗相对作用的药物活性物质的量。“预防作用In此阻止疾病的爆发或甚至病原 体侵入个体后的感染，使得其后续的扩散明显减小或甚至完全使其失去作用。通常，“治疗 相关作用”治愈一种或多种疾病症状或导致一种或多种与疾病或病理改变相关或是其原因 的生理或生化参数部分或完全恢复。根据本发明纳米颗粒的各添加剂量或剂量范围是足够 大的，从而实现免疫应答诱导的所期望的预防或治疗效果。通常，剂量随患者的年龄、体质 和性别变化并应考虑疾病的严重性。可理解，给药的特殊剂量、频率和持续时间此外还取决 于多种因素，如纳米颗粒的靶向能力和结合能力，待治疗个体的饮食习惯、给药类型、排泄 频率和与其它药物的组合。个体剂量可根据原发疾病和可能出现的并发症来调节。精确剂 量由本领域技术人员采用已知的手段和方法可以确定。本发明的前述教导是有效的，且不限于可用在包含纳米颗粒和/或其分散体的药物组合物上，只要这看起来是有意义的。在本发明的一个具体实施方式
中，将纳米颗粒以每公斤体重0. Olmg至Ig的剂量 且每天给药。但优选每公斤体重20至60mg的剂量并每天给药。每天的剂量优选在0.02 至10mg/kg体重。本发明的纳米颗粒和/或纳米颗粒分散体适于预防或治疗选自下组的疾病传染 病、脓毒性休克、肿瘤、癌症、自身免疫性疾病、过敏和慢性或急性炎症过程。可理解，药物制 剂的宿主也包括在本发明的保护范围内。在优选的具体实施方式
中，治疗或预防性防止或防止其复发的癌症性疾病或肿瘤 性疾病选自下组颈-鼻-耳部、纵膈、胃肠道(包括结肠癌、胃癌、大肠癌、小肠癌、胰腺癌、 肝癌)，泌尿生殖系统(包括肾细胞癌)、妇科系统(包括卵巢癌)和内分泌系统以及肺(包 括肺癌)、乳房(包括乳房癌)和皮肤的癌症性疾病或肿瘤性疾病以及骨骼肉瘤和软组织肉 瘤、间皮瘤、黑色素瘤、中枢神经系统肿瘤、在儿童期的癌症性疾病或肿瘤性疾病、淋巴瘤、 白血病、副肿瘤综合征、无显著原发肿瘤的转移(CUP-综合征)、腹膜癌转移、免疫抑制相关 的恶性肿瘤、多发性骨髓瘤和肿瘤转移。本发明所涉及的自身免疫疾病优选自下组，包括关节炎、自身免疫性肝炎、慢性 胃炎、神经性皮炎、牛皮癣、关节病、风湿性疾病、风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、克罗恩 病、化脓性大肠炎(eiternde Dickdarmentz Undung)、糖尿病、炎性肠道疾病、多发性硬化 症和/或过敏性炎症。根据本发明的纳米颗粒也用于预防或治疗疾病，其由能对哺乳动物是致病性的微 生物引起。也就是说，根据本发明的作用不仅针对微生物(其通过干扰在宿主有机体中寄 居的微生物菌群的天然平衡，和/或在免疫低下的宿主中为了自身的利益进行有害健康的 过程)，而且针对那些固有的致病微生物。本发明中优选的微生物是病毒、细菌、真菌和/或 原生动物(tierische Einzeiler)。特别优选的是细菌，其中革兰氏阳性和阴性细菌在其生 长中受到影响。用纳米颗粒治疗的疾病的实例是乙肝、丙肝、HIV、疱疹、结核、麻风或疟疾， 其由上述微生物引起。本领域技术人员已知的是，T细胞增殖和/或中和抗体的诱导几乎在任何时间点 都可以是有利的。目前将纳米颗粒及其分散体主要用于免疫治疗，使得在本发明中的接种 优选是在对免疫治疗有反应的疾病诊断和/或爆发后施用根据本发明的药物制剂。接种应 优选在疾病的诊断或爆发后立即进行，并且作为治疗还可多次施加，以便通过多次注射增 强有机体初始激增的免疫应答。因此，当纳米颗粒以某种间隔给药时，例如为了完全根除疾 病的症状，随诊还理解为治疗性处治的方式。在本发明优选的具体实施方式
中，该纳米颗粒 和/或分散体由此用于治疗癌症和/或肿瘤，特别优选癌症治疗。不言而喻，同样可能有利的是，在有机体中预防性给药后导致产生主动接种防护。 当个体具有上述疾病爆发的特质，如家族性遗传缺陷、基因缺陷或最近经历的疾病时，预防 性免疫治疗是特别值得推荐的。也就是说，本发明还涉及根据本发明的纳米颗粒和/或根据本发明的分散体用于 免疫预防或免疫治疗的用途。本发明的另一主题在于有效量的根据本发明的纳米颗粒和/ 或根据本发明的分散体用于制备免疫预防或免疫治疗的疫苗的用途。这两个主题涉及选自 下组的待治疗疾病传染病、脓毒性休克、肿瘤、癌症、自身免疫性疾病、过敏和慢性或急性炎症过程。所述疫苗特别地如此通过非化学方法制备将活性物质与至少一种固体、液体和 /或半液体载体或辅料和任选地与一种或多种其它活性物质一起转化成合适的剂型。本发 明的前述教导及其具体实施方式
是有效的，且不限于可用在纳米颗粒、分散体及其医药用 途上，只要这看起来是有意义的。本发明的另一实施方案涉及根据本发明的纳米颗粒和/或其分散体用于将抗原 靶向到抗原呈递细胞和任选活化免疫系统，优选活化补体系统的用途。靶向优选以如下方 式离体或体外进行将带有抗原的纳米颗粒施用给涉及抗原呈递细胞的细胞、细胞培养物、 组织或器官。离体应用特别是在源自患有疾病的动物有机体的动物细胞中使用，所述疾病 选自下组传染病、脓毒性休克、肿瘤、癌症、自身免疫性疾病、过敏和慢性或急性炎症过程。 该离体处理的细胞或者继续保留在培养物中用于后续检测，或者移植到动物中，其中可以 涉及宿主动物或其它动物。根据本发明的离体靶向是特别有利的，以便检测所涉及的粒径、 抗原、固定和多官能化的纳米颗粒的特异性构建，使得在评估该离体数据下能够相应地预 调体内的剂量。这些结果中，治疗效果以获得免疫应答的方式被显著提高。同样可能的是， 在机体外直接借助于暴露于纳米颗粒的那些抗原呈递细胞刺激患者的T细胞，并且随后或 者移植该T细胞，或者将该T细胞用于研究目的。在根据本发明用途的一个优选的实施方案中，抗原被导向树突状细胞。在该用途 的特别优选的实施方案中，树突状细胞存在于淋巴结中。可理解，最后提到的实施方案至少 以组织或器官为前提，但最好在完整的动物有机体中。同样可理解，该前提必须满足免疫活 化或特异的补体活化。因此纳米颗粒可以以如下方式在体内应用将其经已知路线直接给动物施用，特 别是哺乳动物，特别优选人类。此外纳米颗粒可以离体使用，其中首先从动物中分离抗原呈 递细胞，随后用根据本发明的纳米颗粒如此进行离体处置，使得纳米颗粒被细胞摄取。将如 此处理的抗原呈递细胞回输到体内，由此刺激有机体的T细胞。因此本发明的另一主题是将抗原靶向到抗原呈递细胞的方法，其具有以下步骤(a)提供含有基本上纯的二氧化硅的纳米颗粒，该纳米颗粒具有表面官能团，在该 表面官能团上固定有至少一种抗原，(b)将所述纳米颗粒施用给在细胞培养物、组织、器官或哺乳动物中含有的抗原呈 递细胞，(c)以如下方式将抗原经组织间液靶向到抗原呈递细胞通过纳米颗粒的粒径调 节靶向效率，两者至少部分地呈反比。在本发明方法的步骤(a)中，纳米颗粒优选通过以下步骤提供(a')在含有水、至少一种增溶剂和至少一种胺或氨的介质中水解缩聚四烷氧基 硅烷和/或有机三烷氧基硅烷，其中首先产生初级粒子的溶胶，并随即通过连续地、按照终 止反应措施地控制地计量加入相应的硅烷阻止进一步成核，使获得的纳米颗粒达到所期望 的粒径，和(a")将至少一种抗原固定在所述纳米颗粒的表面官能团上，和任选地(a"‘)分散纳米颗粒。在根据本发明方法的步骤(b)中，纳米颗粒优选施用给动物，特别优选哺乳动物， 完全特别优选人类。特别是进行肠胃外，特别优选皮内或皮下给药。
目前在步骤(C)中出乎意料地显示，可以通过纳米颗粒的粒径影响二氧化硅颗粒 的靶向。当约150nm的粒径是上限时，在该上限处还观察到一些靶向，而在较小的粒径时靶 向效率提高。颗粒的粒径范围优选大于Onm小于150nm，特别优选5-50nm，完全特别优选 10-30nm，最优选 13_29nm。在本发明的具体实施方式
中，靶向效率和纳米颗粒在整个范围内呈反比。效率可 在此线性和非线性地提高，优选非线性。在本发明另一具体实施方式
中可能的是，靶向效率和粒径之间的反比例不在整个 粒径范围内显示，而是并非在最小的粒径(并由此在粒径范围的端点)时观察到与本发明 相关地接近靶向效率的最大值。在根据本发明方法的实施方案中，优选通过具有大于/等 于2的自然偶次幂的幂函数描述靶向效率(在纵坐标上)对粒径(在横坐标上)的依赖性， 其抛物线向下开口，使得顶点是最大效率。二次函数是特别优选的。换言之，在0-150nm的 上述粒径范围内直至顶点(转折点)观察到反比例。按照该方法可以针对性地调节部分靶向或达到靶向最大化。在本方法的具体实施 方式中，超过50 %的抗原呈递细胞导向到淋巴结，优选超过70 %，特别优选超过85 %，完全 特别优选超过95%。反之，为此优选，使用具有5-50nm粒径的纳米颗粒。粒径包括至少二 氧化硅基质，优选整个纳米颗粒。在根据本发明方法的另一实施方式中，在步骤(c)之后还有其它步骤(d)将纳米颗粒摄入抗原呈递细胞，和任选地(e)在胞内体中释放抗原。优选的是，在步骤(C)之后进行步骤(d)和步骤(e)这两个步骤。在细胞内吞作 用后颗粒状结合基质释放抗原的动力学可以在步骤(e)中控制，其中抗原通过所谓的可裂 解的接头共价连接到载体上。例如可以构建PH敏感的接头、酶切位点(如蛋白酶敏感的接 头)和/或还原性或氧化性可裂解的接头作为表面官能团。本发明优选的PH敏感连接通 过某些酯、二硫化物键、腙接头、酸酐连接、自我裂解的内蛋白序列、PH-敏感的螯合剂或聚 合物，如聚乙烯氧化物改性的聚-β-氨基酯来实现。对于步骤(e)，通过不稳定接头作为表 面官能团的抗原的共价连接是必要的，其中腙接头、二硫化物接头或酶易接近的肽序列是 优选的。此外优选的是，抗原在早期胞内体中释放。本发明的前述教导及其涉及纳米颗粒、其分散体、药物制剂和应用的具体实施方 式是有效的，且不限于可用在将抗原靶向到抗原呈递细胞的方法上，只要这看起来是有意 义的。本发明另一目的还在于在哺乳动物中活化免疫系统的方法，在该方法中，在第一 步骤(a)中根据如上所述的本发明的方法将纳米颗粒导向抗原呈递细胞，并且在第二步骤 (b)中活化免疫系统。优选活化补体系统。在步骤(b)中，活化效率可以通过颗粒特性调 节，为此特别考虑粒径、表面官能团、表面电荷和种类、比例、配体(如抗原、PEG、佐剂)的数 量和密度。在步骤(b)中优选的是，活化效率通过粒径调节，两者至少部分地呈反比。特别 是，活化效率随粒径减小而升高。本发明的前述教导及其涉及将抗原靶向到抗原呈递细胞 的方法的具体实施方式
是有效的，且不限于可用在哺乳动物中用于活化免疫系统或补体系 统的方法上，只要这看起来是有意义的。本发明此外教导了免疫(Vakzinierimg)，其中将有效量的根据本发明的纳米颗粒和/或具有该颗粒的分散体施用给需要此类治疗的哺乳动物。待治疗的哺乳动物优选是 人。本发明的前述教导及其具体实施方式
是有效的，且不限于可用在治疗方法上，只要这看 起来是有意义的。本发明进一步教导了诱导T细胞应答、抗体应答和/或树突状细胞成熟的方法，其 特征在于，将作为分散体和/或药物制剂存在的根据本发明的纳米颗粒施用给哺乳动物， 并诱导T细胞和/或树突状细胞的增殖和/或中和抗体的形成。在本发明中，优选的有机 体是人类或动物。由于根据本发明纳米颗粒的公开，使本领域技术人员能够将其用于诱导 T细胞和/或中和抗体。在此，本领域技术人员已知的是，可以将本发明的纳米颗粒(其明显还可作为根 据本发明的药物制剂使用)以各种剂量施用给有机体，特别是人类患者。在此应如此施用， 使得产生尽可能大的量的T细胞和/或中和抗体。施用的浓度和类型可由本领域技术人员 通过常规实验确定。与纳米颗粒或其药物制剂接触可以进行预防或治疗。例如预防接种，以便在病毒 性传染病之前产生主动接种防护，应至少如此阻止病毒感染，使得在单次病毒入侵后，例如 在伤口中，强烈减少病毒的进一步增殖，或几乎完全杀死入侵的病毒。在免疫应答的治疗性 诱导中，患者已存感染，进行T细胞和/或中和抗体的诱导，以便杀死已在机体中存在的病 毒或抑制其扩增。本发明的另一目的在于有机体的被动免疫，其特征在于，获得通过将根据本发明 的纳米颗粒施用于哺乳动物而诱导的T细胞和/或抗体，并将其施用于其它哺乳动物。本 发明中“其它哺乳动物”是指同类的和不同类的有机体，虽然不是同类有机体，但其诱导所 述的T细胞和/或抗体。也可获得单克隆抗体，尤其在相应的人源化后使用。此外同样可 以从接种的或感染的个体中获得产生抗体的细胞，该细胞产生中和抗体，该中和抗体针对 本发明的纳米颗粒，并且以单克隆抗体的形式在被动免疫中施用。在被动免疫的情况下，在患者机体中，例如对于某些病毒基本上不产生自身的免 疫反应，而是将T细胞和/或抗体例如以血清的形式输给患者。被动免疫具有与主动免疫 相反的任务，尽可能快地治愈已发生的感染，或立即保护免于病毒感染。对于本领域技术人 员而言，例如针对甲肝、乙肝或FSME的用于被动免疫的各种免疫计划是已知的。此类免疫 计划可以通过针对特殊的逆转录病毒，如HIV、猫白血病病毒和其它的病毒通过常规试验来 调整。用于被动免疫的抗体优选是单克隆抗体。其特别是用作联合治疗的组分。对于本领域技术人员而言，所有上述的以及其它的成分均是常用的，并能够在常 规试验中获得根据本发明教导的特殊实施方案。在本发明范围内首次提供了超小的二氧化硅-抗原-缀合物，其在免疫后提高有 效的细胞免疫应答。该缀合物以如下方式描述双重作用机制用于能够特异性靶向抗原呈 递细胞和同时活化补体。与现有技术大的纳米颗粒相比，小于50nm的纳米颗粒具有数倍高 的靶向效率。由于有效地运输到淋巴管中，可以如下有利地利用组织间液的生物物理学机 制将树突状细胞导向到淋巴结。以这种新型运输途径的纳米颗粒的对流使被动靶向成为 可能，由于树突状细胞在淋巴结中大量存在使特别多的细胞被抵达，因此昂贵的细胞特异 性靶向成为多余。这些性质形成可靠地识别淋巴结树突状细胞的基础-其中包括交叉反应 性(包括靶向外周树突状细胞)的缺失-并形成可重复的、可靠的和完全的吞噬作用进入
16这种抗原呈递细胞的基础。在靶向目标上，基于二氧化硅的纳米颗粒承担了第二个有利的 性质，其固有的佐剂效应活化了免疫系统和特别是补体系统。当活化强度独立于所选抗原 时，它可通过粒径而改变。为了活化免疫系统或补体系统无需额外的辅料和/或纳米颗粒 表面改性(如聚羟基化)是明显简单化和成本节约的。根据本发明的纳米颗粒以无机、惰性和生物相容性材料为特征，该材料特别可用 于预防或治疗性免疫。为了改善细胞毒性活性物质的治疗指数，在此由二氧化硅-抗原-缀 合物开发设想的纳米颗粒同样是大有希望的策略。特别地，组分的不稳定连接确保抗原性 治疗剂在身体的特定腔室释放，使得可期望降低可能的副作用。纳米颗粒还以高药学稳定 性为特征，并且不仅仅是由于其较小的粒径而能良好操作。该具有单分散体粒径的超小型 纳米分散体有利地适于可无菌过滤性。可理解，本发明不限于特定的方法、颗粒和条件，如其在此所述的那样，因为这些 事物可以变化。此外还可理解，目前所用的术语仅用于特殊实施方式的描述目的，不应限制 本发明的保护范围。如目前在包括从属权利要求的说明中所使用的一样，单数形式，如“一 个”或“这个”的词形包括相应的复数形式，只要文中没有给出明确的其它说明。例如，“一 个抗原”包括单个抗原或多个抗原，反之，其可以是相同或不同的，或“一种方法”包括相当 的步骤和方法，其对本领域技术人员是已知的。接下来，参照具体实施方式
的非限制性实施例更详细地阐明本发明。该实施例特 别地如下解释其不限于具体详细阐明的特征组合，而是反之可以自由组合示例性的特征， 只要能解决发明的问题。实施例1 单分散的二氧化硅颗粒的制备进行单分散的二氧化硅颗粒的制备——如在EP 0 216 278 Bl所述的——通过在 水-醇-氨介质中水解四烷氧基硅烷，其中首先产生初级粒子溶胶，随后，通过连续地、按照 终止反应措施地控制地计量加入四烷氧基硅烷，使所获得的SiO2颗粒成为所期望的粒径。 为了制备粒径为25nm的50g SiO2颗粒，例如需要1. 2L作为增溶剂的乙醇、860ml去离子水、 167ml正硅酸四乙酯(TEOS)和28. 5ml 25%的水性氨溶液。借助于动态光散射检测用Zetasizer Nano ZS(Malvernlnstruments, Herrenberg, Deutschland)确定球状二氧化硅颗粒。Malvern-PDI (多分散性指数)的值 < 0. 1显示单分散的分布。通过REM摄像在
图1中描述了粒径和颗粒形态。实施例2 具有N端链炔基团的OVA肽片段SIINFEKL的制备在Rink-酰胺树脂上通过Fmoc化学合成所述肽。使用具有合适的侧链保护基团的 N-α-Fmoc-保护的氨基酸。N-甲基-吡咯烷酮用作溶剂。首先在自动合成装置(Applied Biosystems Modell ABI 433A)上制备肽链。在序列合成结束后脱除末端Fmoc保护基团。 在注射器中手工操作使该聚合物与链炔基羧酸偶联。小心地用DMF，之后二氯甲烷和甲醇 清洗，并将树脂在真空中干燥过夜。为了分离和去除保护，将树脂与5ml的TFA/H20/苯酚/ 三异丙基硅烷(37 :1:1: 1)混合物掺混，并在室温下振荡2小时。将TFA溶液转移到 离心玻璃杯中，并在4°C下通过二乙醚的缓慢添加沉淀，离心，通过两次添加二乙醚洗涤，干 燥，并溶于anl H2O/乙腈(1 lv/v)中。通过具有RP-选择B柱(150x10mm)的RP-HPLC 在7. 5分钟内以0% B-100% B的梯度进行纯化(A = H2O和B =乙腈，两者用0. 1 % TFA掺 混)，流速=IOmL/分钟。纯化产品的均勻性和一致性通过分析性HPLC和质谱分析确定。
在RP-HPLC纯化后将所述肽冻干。实施例3 用3-溴丙基三甲氧基硅烷官能化二氧化硅颗粒将Ig在实施例1中制备的SiO2-颗粒(25nm)悬浮在乙醇水混合物中(IOOmL ； 4 1)，并用0. 3mL 25%的水性氨溶液掺混。然后将0. 25mL 3-溴丙基三甲氧基硅烷 (ABCR，卡尔斯鲁厄，德国)溶于IOml乙醇中，通过滴液漏斗缓慢滴加并在回流下加热约20 小时。将反应混合物冷却到室温，并以切的方式用乙醇-水混合物G 1)洗涤SiO2-颗 粒。在9000x g和20°C下在温控离心机中在50mL反应容器中通过离心10分钟和在使用超 声探针(Ultraschallfinger)下通过颗粒的重悬浮进行所有的洗涤步骤。实施例4 官能化的二氧化硅颗粒与叠氮化钠的反应将实施例3中用3-溴丙基三甲氧基硅烷官能化的SiO2-颗粒重新分散于SOmL 二甲亚砜(DMSO)中，与Ig叠氮化钠和IOOmg四丁基溴化铵掺混，并在80°C搅拌40小时。 然后添加200mL去离子水，借助于超滤法在使用具有IOkDa的保留能力的膜(Millipore， Bedford, USA)下分离颗粒并用600mL去离子水洗涤。实施例5 =OVA肽片段SIINFEKL连接在官能化的SiO2-颗粒上将在实施例4中制备的叠氮二氧化硅颗粒重悬浮于40mL乙腈中，并与实施例1的 OVA肽片段(SIINFEKL-链炔基)、二异丙基乙胺(DIPEA)和铜-(I)-碘化物掺混并在室温下 搅拌约20小时。将悬浮液用IOOmL去离子水掺混，借助于超滤通过IOkDa膜(Millipore， Bedford, USA)分离并用200mL去离子水和50mL水性EDTA溶液洗涤。实施例6 在使用PBL-表型(外周血淋巴细胞)作为读出(Read-out)的情况下 检测二氧化硅颗粒的体内佐剂活性该检测在C57B1/6小鼠中进行。将该动物分成3组(每组2只小鼠)，其或被施以 PBS (磷酸盐缓冲液)、LPS (脂多糖)，或者二氧化硅颗粒05nm)。PBS用作对照，并针对二 氧化硅颗粒关于其佐剂活性将LPS基准化为参照(TLR4激动剂)。在试验中，检测25nm粒径的未改性的二氧化硅颗粒，其根据实施例1所述的方法 制备，透析并随后无菌过滤。然后检测二氧化硅分散体是否有内毒素，以便确保动物试验的 读出不受纳米颗粒的内毒素污染而失真。对于0.5IU/ml的液体、肠胃外给药的配制剂，在 检测的纳米颗粒分散体中内毒素浓度在Wi. Eur.推荐的最高水平以下。将各100μ 1测试溶液或测试分散体皮下给药于动物的侧腹。在100μ 1 PBS中纳 米颗粒分散体含有450 μ g 二氧化硅颗粒。作为参照，施以IOyg/小鼠的LPS。借助于肝素 化的毛细管通过眼眶后取血抽取75-100 μ 1外周血/小鼠，并收集在肝素化的Eppendorf 杯中。血液样品用各种检测混合物(Detektions-Cocktails)标记。然后借助于FACS (荧光 激活细胞分选术)确定免疫学相关PBL-表型的百分比分布。在图加-c中，针对4种PBL-亚 群CD4(图2a)、CD8效应细胞(图2b)、⑶Ilb+和CDllC+(DC)(图2c)记录在PBL总的群中 的百分比份额。数据显示，与载体对照PBS相比，在给予二氧化硅颗粒后，T细胞和树突状 细胞的数量在免疫学上显著升高，这显示出二氧化硅颗粒的佐剂效应。实施例7 在水中二氧化硅颗粒的99mTc标记将纳米颗粒溶液(25nm，固体含量9. 0mg/ml)在使用前通过MILEX-GV 0. 22 μ m过 滤器单元过滤。将50 μ 1 二氧化硅纳米颗粒添加到99mTc (132MBq于40 μ 1中)中，并混合溶 液。然后添加2 μ 1的SnCl2溶液(0. 1 % SnC12 二水合物于IOmM HCl中)并再次混合溶液。在约2分钟后，添加150 μ 1的0. 5Μ磷酸盐缓冲液ρΗ 8，并且将溶液转移到微孔Microcon Ultracel YM-100离心过滤装置，并且在13000rpm下离心3分钟。将过滤器各用200 μ 1 0. 5Μ磷酸盐缓冲液ρΗ 8洗涤两次。总滤液含46. 84MBq"mTc。在过滤器中残留69. SBMq99mTc0 将过滤器中的颗粒各在200 μ 1 0.5Μ磷酸盐缓冲液ρΗ 8中悬浮两次，并通过翻转过滤器和 短暂离心回收。获得具有^MBq99mTc-标记的颗粒悬浮液。所获得的颗粒悬浮液随后用于 该动物实验。实施例8 =99mTc-标记的二氧化硅纳米颗粒的体内成像将颗粒如实施例7所述的那样标记。随后在前哨淋巴结中进行针对转移 (Wanderung)的非侵袭性成像。为此目的，借助于吸入麻醉用异氟烷麻醉约400_500g重的 雌性Wistar大鼠。将含10-20MBq99mTc的放射性标记颗粒的澄清悬浮液皮下注射在两个后 爪中一个。随后继续在麻醉下借助于骨扫描检查动物。为此目的，在动物下体的富集处在各 种时间点用Y摄像机照相。摄取动力学显示颗粒在由后爪派生的淋巴结中明显富集(见 图3)。此处是前哨淋巴结。此外，在肾和膀胱中显示临时性富集。而在淋巴结中的富集超 过对小时。可以观察到施加剂量的约的转移率(Wanderungsraten)。作为对照试验，分 析99mTc-标记的纳米Albumon ( 一种商业上可获得的胶体制剂)的转移以表征前哨淋巴结。 该物质的富集与二氧化硅颗粒的富集是相似的。通过其它对照实验，采用将游离的99Ic通 过皮下注射给药到雌性Wistar鼠的两个后爪中一个，使得能够确保游离的99mTc不在淋巴 结中富集。由此可以显示，二氧化硅颗粒能靶向淋巴结，由此可以进行免疫系统的活化。以下实施例涉及药物制剂。实施例A 注射小瓶(Injektionsglaser )将IOOg纳米颗粒和5g磷酸氢二钠的溶液在31双蒸水中用2N盐酸调ρΗ值到6. 8， 无菌过滤，装入注射小瓶中，在无菌条件下冻干，并无菌密封。每个注射小瓶含5mg纳米颗 粒。实施例B:栓剂将IOOg大豆卵磷脂和1400g可可脂与20g纳米颗粒的混合物融化，注入模具并使 其冷却。每枚栓剂含有20mg的纳米颗粒。实施例C:溶剂在940ml双蒸水中准备由Ig纳米颗粒、9. 38g NaH2P04*2H20,28. 48g Na2HPO4* 12H20 和0. Ig洁尔灭组成的溶液。调ρΗ值到6. 8，将溶液定容到1升，并通过辐射灭菌。所述溶 剂可以以滴眼剂的形式使用。实施例D 软膏剂(Salbe)将500mg纳米颗粒与99. 5g凡士林在无菌条件下混合即得。实施例E 片剂将Ikg纳米颗粒、4kg乳糖、1. 2kg马铃薯淀粉、0. 2kg滑石粉和0. Ikg硬脂酸镁的 混合物以常规的方式压制成片剂，使得每片含有IOmg纳米颗粒。实施例F 糖衣丸(Dragees)类似于实施例E压制片剂，随后以常规的方式用出自蔗糖、马铃薯淀粉、滑石粉、 黄蓍胶和染料的包衣将其包衣。
实施例G 胶囊剂以常规的方式将2kg纳米颗粒装入硬明胶胶囊，使得每粒胶囊含有20mg纳米颗 粒。实施例H:安瓿剂将Ikg纳米颗粒于60升双蒸馏水中无菌过滤，装入安瓿瓶中，在无菌条件下冻干 并无菌密封。每支安培瓶含有IOmg纳米颗粒。实施例I:吸入喷雾剂将14g纳米颗粒溶于10升等张的NaCl溶液中，并将该溶液用机械泵装入常规市 售的喷雾容器中。该溶液可以喷入口或鼻中。一次喷射(约0. Iml)相当于约0. Hmg的剂量。
权利要求
1.包含由超过50%的二氧化硅构成的基质的纳米颗粒，其具有至少一种表面官能团， 在该表面官能团上固定有至少一种抗原，其特征在于，所述颗粒具有5-50nm的粒径。
2.根据具有以下步骤的方法制备的纳米颗粒(a)在含有水、至少一种增溶剂和至少一种胺或氨的介质中水解缩聚四烷氧基硅烷和 /或有机三烷氧基硅烷，其中首先产生初级粒子的溶胶，并随即通过连续地、按照终止反应 措施地控制地计量加入相应的硅烷阻止进一步成核，使获得的纳米颗粒达到在5-50nm范 围内的所期望的粒径，和(b)将抗原固定在所述纳米颗粒的表面官能团上。
3.根据权利要求2的纳米颗粒，其特征在于，在步骤(a)之后且在步骤(b)之前将所述 表面官能化。
4.根据前述权利要求任一项的纳米颗粒，其特征在于，所述表面官能团是不稳定接头 或是烷氧基硅烷，优选二硫化物接头、酶可接近的肽序列、腙接头或末端反应性硫醇基团。
5.根据前述权利要求任一项的纳米颗粒，其特征在于，所述表面是多官能化的，其中排 除多官能团的交联，优选将表面与抗原和PEG和/或佐剂以吸附或共价的方式多官能化。
6.根据前述权利要求任一项的纳米颗粒，其特征在于，所述颗粒具有10-30nm的粒径， 优选 25nm士 10%。
7.根据前述权利要求任一项的纳米颗粒，其特征在于，是有孔的或是无孔的。
8.根据前述权利要求任一项的纳米颗粒，其特征在于，是单分散体。
9.根据前述权利要求任一项的纳米颗粒，其特征在于，所述抗原是癌症抗原，优选是生 存素或其表位。
10.含有根据前述权利要求任一项的纳米颗粒的分散体。
11.根据权利要求10的分散体，其特征在于，所述纳米颗粒是单分散体且是不聚集的。
12.含有根据权利要求1-9任一项的纳米颗粒和/或根据权利要求10或11的分散体 的试剂盒。
13.药物制剂，其包含根据权利要求1-9任一项的纳米颗粒和/或权利要求10或11的 分散体。
14.根据权利要求13的药物制剂用于肠胃外施用。
15.药物组合物，其包含作为活性物质的有效量的根据权利要求1-9任一项的纳米颗 粒和/或根据权利要求10或11的分散体以及药学上可接受的辅料。
16.根据权利要求1-9任一项的纳米颗粒和/或根据权利要求10或11的分散体用于 预防或治疗选自下组的疾病传染病、脓毒性休克、肿瘤、癌症、自身免疫性疾病、过敏和慢 性或急性炎症过程。
17.根据权利要求16的纳米颗粒和/或分散体用于预防或治疗肿瘤和/或癌症，优选用于治疗癌症。
18.根据权利要求1-9任一项的纳米颗粒和/或根据权利要求10或11的分散体的用 途，用于制备用于免疫预防或免疫治疗的疫苗。
19.根据权利要求1-9任一项的纳米颗粒和/或根据权利要求10或11的分散体的用 途，用于将抗原靶向到抗原呈递细胞和任选地用于免疫系统的活化。
20.根据权利要求19的应用，其特征在于，将抗原靶向淋巴结中的树突状细胞。
21.根据权利要求19或20的离体应用。
22.将抗原靶向到抗原呈递细胞的方法，其具有以下步骤(a)提供含有基本上纯的二氧化硅的纳米颗粒，该纳米颗粒具有表面官能团，在该表面 官能团上固定有至少一种抗原，(b)将所述纳米颗粒施用给在细胞培养物、组织、器官或哺乳动物中含有的抗原呈递细胞，(c)以如下方式将抗原通过组织间液靶向到抗原呈递细胞通过纳米颗粒的粒径调节 靶向效率，两者至少部分地呈反比。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述纳米颗粒通过以下步骤 提供(a')在含有水、至少一种增溶剂和至少一种胺或氨的介质中水解缩聚四烷氧基硅烷 和/或有机三烷氧基硅烷，其中首先产生初级粒子的溶胶，并随即通过连续地、按照终止反 应措施地控制地计量加入相应的硅烷阻止进一步成核，使获得的纳米颗粒达到所期望的粒 径，和(a")将至少一种抗原固定在所述纳米颗粒的表面官能团上，和任选地 (a"‘)分散纳米颗粒。
24.根据权利要求23的方法，其特征在于，在步骤(a")中，所述表面是多官能化的， 其中排除多官能团的交联，优选将表面与抗原和PEG和/或佐剂以吸附或共价的方式多官 能化。
25.根据权利要求22-M任一项的方法，其特征在于，在步骤(a)中提供粒径为5-50nm 的有孔或无孔的纳米颗粒。
26.根据权利要求22-25任一项的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述表面官能团是 不稳定接头或是烷氧基硅烷，优选二硫化物接头、酶可接近的肽序列、腙接头或末端反应性硫醇基团。
27.根据权利要求2216任一项的方法，其特征在于，在步骤(b)中将所述纳米颗粒施 用给哺乳动物，优选肠胃外给药。
28.根据权利要求22-27任一项的方法，其特征在于，在步骤(c)中，将超过50%的抗 原呈递细胞导向到淋巴结。
29.根据权利要求22- 任一项的方法，其特征在于，在步骤(c)之后还包括其它步骤(d)将纳米颗粒摄入抗原呈递细胞，和任选地(e)在胞内体中释放抗原。
30.根据权利要求四的方法，其特征在于，在步骤(e)中在早期胞内体中释放抗原。
31.在哺乳动物中用以下步骤活化免疫系统的方法(a)根据权利要求22-30中任一项的方法将纳米颗粒靶向到抗原呈递细胞，以及(b)活化免疫系统。
32.根据权利要求31的方法，其特征在于，在步骤(b)中通过粒径调节活化效率，两者 至少部分地呈反比。
33.疫苗接种方法，其特征在于，给需要这种治疗的哺乳动物施以有效量的根据权利要求1-9任一项的纳米颗粒和/或根据权利要求10或11的分散体。
34.诱导T细胞应答、抗体应答和/或树突状细胞成熟的方法，其特征在于，给哺乳动物 施以根据权利要求1-9任一项的纳米颗粒和/或根据权利要求10或11的分散体，并诱导 T细胞和/或树突状细胞的增生和/或中和抗体的形成。
35.被动免疫哺乳动物的方法，其特征在于，获得按照根据权利要求30的方法增生的T 细胞和/或形成的抗体并施用给哺乳动物。
全文摘要
本发明涉及由二氧化硅制备的超小、单分散的纳米颗粒，在其表面上固定有至少一种抗原。该纳米颗粒可用于免疫预防或免疫治疗癌症。本发明还涉及将抗原靶向到抗原呈递细胞和活化免疫系统的方法，其中靶向效率和/或免疫活化通过颗粒特性调节。本发明还涉及哺乳动物的主动和被动免疫。
文档编号A61K9/16GK102099014SQ200980127650
公开日2011年6月15日 申请日期2009年7月13日 优先权日2008年7月15日
发明者A·哈尼菲尔德, A·屈贝尔贝克, G·拉尔比格, M·韦加特 申请人:默克专利股份有限公司