吡唑并嘧啶类化合物及其药物组合物和其在制药中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供结构式（I）所示的吡唑并嘧啶类化合物，其为活性成分的药物组合物，它们的制备方法，以及在制备TRPC6调节剂探针药物及在制备防治肾小球疾病及心肌肥大症相关药物中的应用。本发明中的吡唑并嘧啶及其衍生物可制备成各种形式的药物制剂，包括口服、注射、肺吸入制剂、透皮制剂，具体包括注射剂、口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂、气雾剂、粉雾剂、喷雾剂、贴剂等。
【专利说明】吡唑并嘧啶类化合物及其药物组合物和其在制药中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于药物化学领域，具体地，涉及一种吡唑并嘧啶类化合物及其药物组合物和它们的制备方法，以及在制备TRPC6调节剂探针药物及在制备防治肾小球疾病及心肌肥大症等相关药物中的应用。
【背景技术】
[0002]肾小球是肾脏内的血液过滤器，在参与调节尿液成分中起着非常重要的作用。肾小球的毛细管壁构成高选择性的过滤膜，过滤膜有三层结构，从内到外分别为:多孔的内皮细胞层、控制滤过分子大小的肾小球基膜以及上皮细胞层，又称足细胞层。过滤膜对水和小分子都有较高的透过率，从而使其容易进入泌尿空间，但对于血浆蛋白比如白蛋白等却有极高的过滤功能。
[0003]肾小球过滤屏障的破坏导致许多肾脏疾病，包括糖尿病肾病，IgA肾炎，狼疮性肾炎，局灶节段性肾小球硬化等。蛋白尿(尿液中有蛋白质出现)是肾小球选择渗透性损失的标志，持续性肾小球过滤屏障损坏导致进行性的肾功能衰竭。总之，肾小球疾病是肾功能衰竭的主要原因，临床上需要透析或者肾移植治疗。
[0004]由于其临床上的重要性以及独特的生物学特性，肾脏病研究者们一直致力于研究肾小球过滤屏障。通过罕见的家族性肾小球疾病的，研究科学家们希望找出参与建立和维持肾小球滤过屏障的关键基因，结果发现在这些疾病中几个被影响的蛋白是足细胞表达的。足细胞，即肾小囊脏层上皮细胞，足细胞呈星型多突状，胞体较大，由胞体伸出许多突起，又称足突(FP)。两相邻足突间的空隙称为裂孔，其表面覆盖一层拉链状的结构-裂孔隔膜(slit diaphragm, SD),是过滤血衆蛋白的最后屏障，也是液体进出足细胞的地方，裂孔隔膜表面是由硫酸蛋白等组成的阴离子外衣，这是肾小球电荷屏障的重要组分之一。近年来发现，以蛋白尿为特征的肾小球疾病中都出现了足细胞复杂结构破坏和裂孔隔膜的功能损失，遗传学的研究更是将足细胞的研究放在了肾小球疾病研究的首位。
[0005]TRPC,即瞬时受体电位通道(transient receptor potential cation channel)属于TRP亚家族，是细胞膜上的一种非选择性的阳离子通道跨膜蛋白，TRPC通道由6个跨膜α螺旋组成，TRPC通道蛋白的结构基础是第由5、6跨膜结构域共同构成的发卡式的阳离子通道结构。每个TRPC亚基包含一个跨膜区域和与之相邻的并且位于细胞内N和C末端，这两个末端是蛋白与蛋白之间通过相互作用来协调通道转运、锚定、定位、门控和功能调节的关键位点。TRPC末端通常含有3-6个与锚蛋白(ankyrin)结合的位点，N末端的锚蛋白重复序列和卷曲螺旋区域是四聚体通道组件的基本元件，锚蛋白与TRPC通道相互作用能够抑制肌醇三磷酸受 体(IP3-R)和兰尼碱受体(ryanodine receptor)调节的细胞内Ca2+释放。
[0006]瞬时受体电位阳离子通道6(transientreceptor potential cation channels6,TRPC6)属于TRPC超家族，由TRPC6基因编码，含931个氨基酸，在人体的肝脏、肾和肺等器官中均有表达，人类TRPC6基因定位于常染色体llq21222。近年来的研究表明，TRPC6的基因突变或过表达引起胞内钙离子信号通路异常，从而导致肺血管重塑、肿瘤细胞增殖及心肌肥厚等多种病理生理改变。因此，有关TRPC6作为疾病治疗靶点的研究成为人们关注的执占。
[0007]Winn等利用免疫荧光发现TRPC6在正常人的肾小球和肾小管中都有明显表达，Reiser等通过激光共聚焦技术进一步证实了这个结论，而且在肾小球中，TRPC6蛋白主要表达于足细胞。MSller通过免疫金标记实验发现TRPC6主要分布于足细胞胞体，特别在临近裂孔隔膜的足细胞足突表达更为明显；此外，还发现TRPC6与足细胞骨架蛋白η印hrin，podocin,⑶2AP等共同表达于相邻足细胞膜连接区域。接下来的免疫共沉淀证实，TRPC6可与nephrin, podocin,⑶2AP等蛋白相互作用，推测它们一起组成裂隙膜上的一个信号复合体，共同调节足细胞的功能。
[0008]2005年，Winn等人报道了在一个常染色体显性遗传模式的成人患病的局灶节段性肾小球硬化(FSGS)大家庭中发现了 TRPC6基因的突变。MSller等发现在FSGS、微小病变性肾病(minimal2change disease,MCD)和膜性肾病(memberanous glomerulo2nephritis,MN)等人类非遗传性蛋白尿性肾脏疾病患者中，TRPC6表达显著增加。Yu等将氨基核苷嘌呤罗霉素注射大鼠，检测发现随着TRPC6水平的增加，足细胞的损伤逐渐加重，蛋白尿逐渐加重。随后将受损的足细胞体外培养，使用地塞米松(TRPC6)抑制剂处理细胞，结果显示足细胞中TRPC6水平明显减少，且足细胞的受损得到了一定程度的修复。由此可以推测，TRPC6的突变或过表达会使足细胞因钙离子内流加强，进而引起FSGS的发生，而对过表达或突变的TRPC6通道进行封闭可以 作为缓解或改善FSGS等蛋白尿性肾脏疾病的理想策略。因此，寻找TRPC6调节剂(包括激活剂或抑制剂)并开发成为防治肾小球疾病的药物具有广阔的社会和经济效益前景同时，TRPC6通道与心肌肥厚过程的钙离子浓度密切相关，其过表达可使心肌细胞内钙浓度增高，成为诱发心肌肥厚的重要机制之一。Chu等将初生小鼠心肌细胞在轻度缺氧条件下培养，发现低氧诱导因子HIF-1 α增加，从而激活TRPC6通道，导致细胞外钙内流从而引起胞内钙离子浓度的增加，激活了 T细胞核因子(nuclear factorofactivated T cells, NFAT)信号通路,而使心肌细胞重建引起心肌肥厚。Nakayama等报道，TRPC6作为上游调节物调节钙调磷酸酶-NFAT途径，实验发现当TRPC6被二酰甘油激活，与受体磷脂酶C结合导致钙离子大量流入心肌细胞，激活该信号通路。TRPC6蛋白69位苏氨酸磷酸化会导致TRPC6的活性的抑制。Kinoshita等整合了 TRPC6第69位的苏氨酸被丙氨酸替代的突变体T69A的小鼠心肌细胞，结果ANP对钙调磷酸酶-NFAT途径及钙离子流入几乎没有抑制作用。同时发现，敲除GC-A的小鼠心肌细胞中TRPC6表达明显增强，钙调磷酸酶-NFAT途径被激活，导致钙离子流入增强，随后对GC-A敲除的小鼠连续4周注射TRPC6抑制物3，5-二三氟甲基吡唑，结果显示心肌肥厚症状减轻。由此可推断在心肌细胞中，可以通过抑制TRPC6在ANP/BNP-GC-A途径中的作用防治心肌肥厚疾病，寻找有效的TRPC6激活剂或抑制剂是潜在的防治肥厚性心肌病的重要途径。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题在于提供一种吡唑并嘧啶类化合物，以其为活性成分的药物组合物，它们的制备方法，以及在制备TRPC6调节剂探针药物和在制备防治肾小球疾病及心肌肥大症相关药物中的应用。[0010]为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:
[0011]如下结构式(I)所示的吡唑并嘧啶类化合物，
[0012]
【权利要求】
1.如下结构式(I)所示的批唑并喃唳类化合物，
k^N、N,
2.如权利要求1所述的吡唑并嘧啶类化合物,为下列化合物:
3.权利要求1所述化合物R4为羟基时的制备方法，按照下述路线制备，
4.如权利要求3所述化合物R4为羟基时的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤: 步骤a:无水条件下,取中间体或原料,加入N, N’ -羰基二咪唑,加入新蒸THF,室温下搅拌4h,得到中间体2,旋蒸除掉THF,未纯化直接进行下一步反应； 步骤b:取丙二酸单乙酯钾盐，加入新蒸THF和重蒸CH3CN,降温至(TC，加入无水MgCl2,DMAP,升至室温搅拌6h，降温至(TC，将中间体2溶于新蒸THF，与Et3N同时滴加入圆底烧瓶，缓慢升至室温搅拌过夜，反应结束后，降温至0°C，加入IM HCl，Et20萃取，合并Et2O相用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤旋干，用200-300目硅胶过柱分离可得产品为浅黄色油状液体3 ； 步骤d:在微波管中加入液体3，微波反应100°C 2h，取盐酸肼，加入Et0H，H20，将微波反应液加入其中，80 0C回流过夜，反应结束后冷却反应液至室温，用饱和NaHCO3碱化，EA萃取，合并EA相用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤旋干，用PE和EA重结晶得浅黄色固体7 ； 步骤e:取中间体3，中间体7加入乙酸溶解，130°C过夜反应，反应结束后旋蒸除去乙酸，滴加NaOH，析出大量灰白色固体，将其过滤，用少量MeOH洗涤，得到化合物8。
5.权利要求1所述化合物在制备作为TRPC6激活剂或抑制剂的探针药物中的应用。
6.权利要求1所述化合物在制备防治肾小球疾病及心肌肥大症的药物中的应用。
7.药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。
【文档编号】A61P9/00GK103694242SQ201310666552
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】罗怀容, 洪学传, 朱曦, 朱进妹, 吴桂生, 邓子新, 朱颖旻, 陆云刚, 邓科, 瞿春容 申请人:中国科学院昆明植物研究所, 武汉大学