本申请是申请号为cn201210017896.5，申请日为2012年1月19日，发明名称为“一种含有vegf拮抗剂的滴眼液”的分案申请。本发明涉及医药制剂领域，具体涉及一种含有vegf拮抗剂的滴眼液。
背景技术：
：角膜新生血管、新生血管性青光眼、翼状胬肉、慢性结膜炎等眼表病的发病均与新生血管的产生有一定的关系，vegf的过度表达可以诱导眼表新生血管形成。其中角膜新生血管不是一种独立的角膜病，而是一种病理改变。导致角膜新生血管的原因很多，免疫炎症性、感染性、变性、外伤性、隐形眼镜的不当使用，医源性疾病等。上述原因导致的角膜新生血管如果不及时治疗，最终会导致角膜盲。角膜新生血管为世界范围视力丧失和失明的主要原因，在美国约4.14％的眼科患者患有角膜新生血管，美国每年有140万新增角膜新生血管患者，其中12％的会导致视力下降，在美国每年有约17万新增视力下降的角膜新生血管患者。中国尚没有关于角膜新生血管的流行病学调查，如果按照美国角膜新生血管占眼科患者4％，其中12％会导致视力下降来计算，2009年全国眼科患者为6283万，国内每年约有30万的新增患者因角膜新生而影响视力。患者角膜新生血管进展会导致视力的进一步恶化，最终需要角膜移植才能恢复视力。因此此类患者需要进行有效的抗新生血管治疗，以防止视力进一步丧失，同时避免进行角膜移植，医生对于角膜新生血管没有有效的治疗手段。生物药物，尤其是重组类蛋白许多特性完全不同于小分子化学分子，其发生不稳定降解反应是一个多步骤反应。限于目前分析方法的局限，发生于高级结构的这些饱含多个步骤的降解也很难精确测量到，其稳定性，尤其在常规条件下的保存就是一个很大的挑战。眼睛是人体最重要的器官之一：大脑的近80％的信息来自眼睛；同时眼睛由于其特殊的生理构造，是比较柔弱的组织，对粘度，渗透压等要求都非常高。因此对于眼用制剂，尤其是有外伤时候采用的眼用制剂要求异常严格。vegf(血管内皮细胞生长因子)的生物学效应均是通过其特异性受体vegfr(血管内皮细胞生长因子受体)介导来实现的，vegfr可导致由配体介导的二聚体化，受体的二聚体化促使相邻受体亚基自身磷酸化和去磷酸化，从而触发信号转导。vegfr均为酪氨酸蛋白激酶，按其功能和结构分为：fins-样酪氨酸激酶-1(vegfr-1/flt-1)、激酶插入区受体(vegfr-2/flk-1/kdr)、fins-样酪氨酸激酶-4(vegfr-3/flt-4)及一些低相对分子质量vegfr(neuropilin-1)。flt-1和kdr主要分布于血管内皮细胞上，flt-4则主要分布于淋巴管内皮细胞上。与vegf相结合的主要为flt-1和kdr，flt-1与vegf的结合力较kdr高，他们都是糖基化的跨膜受体，直接参与vegf进入细胞内的信号传递。flt-1与vegf结合后能促使血管内皮细胞的形成和调节血管渗透性；kdr与vegf结合后则能促进血管内皮细胞的增生及成熟。vegf拮抗剂，尤其是一类人工设计的靶向基因工程蛋白，如lucentis、avastin、vegf-trap等等，它们能有效地阻断由血管内皮生长因子(vegf)介导的信号传递，抑制病变新生血管的生长，并用于治疗肿瘤、眼睛等由新生血管引起的疾病，但是上述药物的已上市的制剂形式为注射剂，其给药方式为玻璃体直接注射或全身给药，其制剂形式对于患者而言，其依从性差，且存在诸多不便。因此，研究者开始研究一种患者依从性好，且方便有效的含有vegf拮抗剂的药物制剂形式，us7303748公开了一种含有vegf-trap的滴眼液，其制剂处方:39.4-103.06mg/mlvegf-trap，5mm磷酸，5mm柠檬酸，100mm氯化钠，0.005％吐温-20。但是该滴眼液浓度较大，由于生物制剂一般都存在不稳定的问题，目前眼表的抗血管治疗患者很多都不愿住院治疗，高浓度的生物制剂很容易造成保存和使用的不便，同时眼表给药是一个特殊的给药途径，对ph、渗透压和局部刺激性，不能添加抑菌剂和抗菌剂等，上述问题使得用于眼表抗新生血管治疗药物的成本昂贵，效果有限。因此，提供一种浓度低，抑制新生血管疗效确切的滴眼液，并将其用于治疗角膜新生血管、新生血管性青光眼、翼状胬肉、慢性结膜炎等多种眼表疾病，对于满足临床需求具有显著的意义。技术实现要素：本发明需要解决技术问题之一是提供一种浓度小但是疗效确切的含有vegf拮抗剂的滴眼液。为了解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：本发明一方面提供了一种含有vegf拮抗剂的滴眼液，该滴眼液中含有0.05-9.0mg/ml的vegf拮抗剂；优选含有0.1-1.0mg/ml的vegf拮抗剂；更优选含有0.5mg/ml的vegf拮抗剂；其中所述vegf拮抗剂优选为含有flt-1和kdr的片断的融合蛋白。上述vegf拮抗剂优选具有如下结构之一的融合蛋白：a.fp1，由flt-1的第2免疫球蛋白样区域和kdr的第3免疫球蛋白样区域与人免疫球蛋白fc片段融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3-fc；b.fp2，由kdr的第1免疫球蛋白样区域，flt-1的第2免疫球蛋白样区域和kdr的第3免疫球蛋白样区域与人免疫球蛋白fc片段融合而成的蛋白：kdrd1-fltd2-kdrd3-fc；c.fp3，由flt-1的第2免疫球蛋白样区域和kdr的第3-4免疫球蛋白样区域与人免疫球蛋白fc片段融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3,4-fc；d.fp4，由flt-1的第2免疫球蛋白样区域，kdr的第3免疫球蛋白样区域和flt-1的第4免疫球蛋白样区域与人免疫球蛋白fc片段融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3-fltd4-fc；e.fp5，由flt-1的第2免疫球蛋白样区域和kdr的第3-5免疫球蛋白样区域与人免疫球蛋白fc片段融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3,4,5-fc；或f.fp6，由flt-1的第2免疫球蛋白样区域，kdr的第3免疫球蛋白样区域和flt-1的第4-5免疫球蛋白样区域与人免疫球蛋白fc片段融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3-fltd4,5-fc；g.fp7，由flt-1的第2免疫球蛋白样区域和kdr的第3-4免疫球蛋白样区域融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3,4；h.fp8，由flt-1的第2免疫球蛋白样区域和kdr的第3免疫球蛋白样区域融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3。以上flt-1和kdr免疫球蛋白样区域的氨基酸flt-1d2、flt-1d4、kdrd1、kdrd3、kdrd4见序列表1-5，fp3蛋白的氨基酸序列见序列表6、fp1蛋白的氨基酸序列见序列表7，fp7蛋白的氨基酸序列见序列表8，fp8蛋白的氨基酸序列见序列表9。本发明提供的滴眼液中，还可以含有以下组分的一种或多种：(a)5-100mm缓冲液，其中的酸选自tris-hcl，柠檬酸，磷酸、磷酸氢钠，磷酸二氢钠，醋酸，丁二酸，盐酸中的一种或多种；(b)5-500mm碱性氨基酸选自赖氨酸，精氨酸，和组氨酸中的一种或其组合；(c)0.1-30％盐渗透压剂调节剂，其中的糖选自蔗糖，海藻糖，甘露醇，甘油，丙二醇，山梨酯醇中的一种或多种，盐选自氯化钠或其它药学上可以接受的盐中的一种或其组合；(d)0.005-0.1％的一种或多种表面活性剂或助溶剂，选自聚乙二醇，吐温20，吐温80，丙二醇，二甲基亚砜或其它药学上可以接受的表面活性剂中的一种或多种；上述组分之一或多种配成的溶液ph为6～8.3。上述滴眼液中所述的vegf拮抗剂最优选为如seqidno:6的融合蛋白。本发明还进一步提供了含有如下组分的滴眼液，具体组分如下：(a)0.05-9mg/ml的如seqidno:6的融合蛋白；(b)5-250mm的柠檬酸；(c)5-500mm的精氨酸或组氨酸的一种或两种；(d)4-30％的蔗糖或海藻糖；(e)0.01-0.1％的表面活性剂或助溶剂，选自聚乙二醇或吐温20的一种或两种；(f)调节ph为7.5～8.3。本发明再进一步提供了含有如下组分的滴眼液，具体组分如下：(a)0.1-1mg/ml的如seqidno:6的融合蛋白；(b)10-50mm的柠檬酸；(c)50-100mm的精氨酸或组氨酸的一种或两种；(d)5-20％的蔗糖；(e)0.01-0.1％的表面活性剂或助溶剂，选自聚乙二醇或吐温20的一种或两种；(f)调节ph为7.5～8.3。本发明更进一步提供了含有如下组分的滴眼液，具体组分如下：(a)0.5mg/ml的如seqidno:6的融合蛋白；(b)50mm的柠檬酸；(c)250mm的精氨酸；(d)12.5％的蔗糖；(e)0.05％的吐温-20；(f)调节ph为7.5～8.3。本发明还提供了上述滴眼液在制备治疗由血管新生或生长引起的眼表疾病的药物中的用途；优选为眼表疾病为角膜移植术后新生血管、角膜新生血管、眼表新生血管或翼状胬肉的任一种或其并发症。中国专利zl200510073595.4和zl200610066257.2公开的技术内容作为本申请的参考；中国未公开专利cn201010267503.7的技术内容也作为本申请的参考。本发明与现有技术相比其优势在于：滴眼液中融合蛋白的含量极低、且疗效确切，在低浓度滴眼液较高的稳定性的基础上能够大幅度节约生产成本。具体实施方式以下实施例仅作为对本发明的进一步解释，不能作为是对本发明保护范围的限制。实施例1、康柏西普滴眼液对碱烧伤致角膜新生血管研究药品：盐酸金霉素眼膏，规格批号：2.0g/支，411002，有效期至2014.12，重庆科瑞制药有限责任公司；盐酸利多卡因注射液，规格批号：5ml/支，0.1g/支，有效期至2012.04.，天津药物焦作有限公司。试剂：氢氧化钠(naoh)，规格批号：500g/瓶，20091223，成都市科龙化工试剂厂。受试样品：a，康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)10mg/ml，无色透明液体，1ml/支，批号：fr1108001，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；b，康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)9mg/ml，无色透明液体，1ml/支，批号：fr1108002，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；c，地塞米松，无色透明液体，1ml/支，批号：fr1108003，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；d，康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)0.1mg/ml，无色透明液体，1ml/支，批号：fr1108004，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；e，不含康柏西普制剂缓冲液(buffer)(按照实施例16制备)，无色透明液体，1ml/支，批号：fr1108005，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；f，康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)5mg/ml，无色透明液体，1ml/支，批号：fr1108006，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；均由康弘药业集团企业技术中心中化药研究部制剂室提供。实验方法及结果：取健康无眼疾病新西兰兔48只，称其体重，用3％戊巴比妥钠麻醉(1ml/kg)，并于眼睛表面施予局麻药盐酸利多卡因液，剂量为20μl/眼；制备9mm直径滤纸片，浸泡于1mol/lnaoh溶液中约10s，用镊子将滤纸片放置于干燥的滤纸上吸去多余的naoh溶液，将浸有naoh的滤纸片置于家兔双眼眼角膜正中60s后取下，迅速取洗瓶用约20ml生理盐水冲洗角膜，并给予预防抗生素防止感染(盐酸金霉素眼膏)，3次/2天。造模后随即分为烧伤、a(康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)10mg/ml)、b(康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)9mg/ml)、c(地塞米松)、d(康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)0.1mg/ml)、e(不含康柏西普的制剂缓冲溶液(按照实施例16制备))和f(康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)5mg/ml)七个组，造模当天为0天，从第1天开始，a～f组给予相应药物，给药频率6次/天，给药剂量每次50μl/眼，连续给药10天，另取2只新西兰兔设为正常组。每天给药同时，观察眼角膜nv生长状态及眼部是否有炎症反应。于给药第10天，以3％戊巴比妥钠溶液麻醉动物(1ml/kg)，并于眼睛表面施予局麻药盐酸利多卡因液，剂量为20μl/眼，在裂隙灯10倍物镜下观察兔眼角膜nv钟点方向，同时在10倍和16倍物镜下照相。采集图像在photoshopcs进行钟点数校正，角膜新生面积采用imageproplus处理；面积公式：s＝c/12×3.1416×[r2-(r-l)2]，c表示在图片中角膜边缘从有nv到无nv生长时点所占的钟点数，r表示在图片中从角膜与巩膜接触的边缘到角膜中心的长度，l表示在图片中从角膜与巩膜接触边缘nv的根部到角膜中nv的末端nv长度，每个钟点中取最长的一根血管长度。所有数据统计分析采用t检验方差分数据表示，是平均值，s是标准偏差。通过一般眼表观察发现，烧伤第1,2天各组烧伤眼角膜边缘血管网充血明显；烧伤第3天，角膜边缘有nv生长；第5天康柏西普滴眼液5mg/ml和不含康柏西普的制剂缓冲溶液眼角膜表面nv生长明显，地塞米松、康柏西普滴眼液10mg/ml、康柏西普滴眼液9mg/ml和康柏西普滴眼液0.1mg/ml组nv生长不明显；第7天各组眼角膜表面nv生长明显，烧伤组和不含康柏西普的制剂缓冲溶液组角膜nv向烧伤角膜生长，部分nv已生长到烧伤角膜边缘，而地塞米松、康柏西普滴眼液10mg/ml、康柏西普滴眼液9mg/ml、康柏西普滴眼液5mg/ml和康柏西普滴眼液0.1mg/ml组很少有nv生长到烧伤角膜边缘；第10天时烧伤组和不含康柏西普的制剂缓冲溶液组已有nv长入烧伤角膜内，而地塞米松、康柏西普10mg/ml、康柏西普滴眼液9mg/ml、康柏西普5mg/ml和康柏西普0.1mg/ml组nv长入烧伤角膜较少。角膜新生血管面积影响：第10天角膜nv面积数据分析结果可知，与碱烧伤组和不含康柏西普的制剂缓冲溶液组相比，地塞米松、康柏西普10mg/ml、康柏西普滴眼液9mg/ml、康柏西普5mg/ml和康柏西普0.1mg/ml能够明显抑制角膜nv生长，减少nv面积，具有统计学意义(p<0.05)，其中地塞米松与康柏西普0.1mg/ml抑制nv生长最佳(p<0.01)。虽然不含康柏西普的制剂缓冲溶液无抑制角膜新生血管生长作用，且nv面积大于烧伤组，但无显著性差异。结果如表1。表1各药物对碱烧伤致兔眼角膜nv的影响注：阴性对照为不含药物的缓冲液，阳性对照为地塞米松，与烧伤组比较，*p<0.05,**p<0.01；与b组比较，#p<0.05,##p<0.01；与e组比较，^p<0.05,^^p<0.01。实施例2低剂量康柏西普滴眼液对碱烧伤致角膜nv生长影响药品：盐酸金霉素眼膏，规格批号：2.0g/支，411002，有效期至2014.12，重庆科瑞制药有限责任公司；盐酸利多卡因注射液，规格批号：5ml/支，0.1g/支，有效期至2012.04.，天津药物焦作有限公司。试剂：氢氧化钠(naoh)，规格批号：500g/瓶，20091223，成都市科龙化工试剂厂。受试样品：a，康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)0.5mg/ml，无色透明液体，800μl/支，批号：20111001，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；b，康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)0.1mg/ml，无色透明液体，800μl/支，批号：20111001，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；c，不含康柏西普的制剂缓冲溶液，无色透明液体，800μl/支，批号：20111001，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；d，康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)0.01mg/ml，无色透明液体，800μl/支，批号：20111001，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；e，地塞米松，无色透明液体，800μl/支，批号：20111001，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；f，康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)0.05mg/ml，无色透明液体，800μl/支，批号：20111001，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；g，康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)1mg/ml，无色透明液体，800μl/支，批号：20111001，保存于2～8℃，使用时滴加入眼睛表面；均由康弘药业集团企业技术中心中化药研究部制剂室提供。实验方法及结果：试验分为a(康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)0.5mg/ml)、b(康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)0.1mg/ml)、c(不含康柏西普的制剂缓冲液(按照实施例16制备)buffer)、d(康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)0.01mg/ml)、e(地塞米松)、f(康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)0.05mg/ml)和g(康柏西普滴眼液(按照实施例3制备)1mg/ml)八个组。试验方法操作同实施例1。通过眼表观察发现，烧伤第1,2天各组烧伤眼角膜边缘血管网充血明显，部分眼睑红肿现象；烧伤第3天，角膜边缘有nv生长趋势，眼睑红肿消退；第5天，各组角膜表面有nv生长，但是有部分兔眼睑又出现红肿现象；第7天各组眼角膜表面nv生长明显，有明显地向心性生长，而地塞米松组角膜nv较少，但兔眼睑红肿现象更加严重；第10天，含有康柏西普的各组角膜nv生长明显，部分角膜新生血管已长入烧伤部位，而地塞米松组nv长入角膜烧伤部位较少，兔眼睑红肿现象未见恢复，而含有康柏西普的各组未有兔眼睑红肿现象。角膜新生血管面积影响：第10天角膜nv面积数据分析结果可知，与不含康柏西普的制剂缓冲溶液组相比，地塞米松、康柏西普滴眼液0.5mg/ml能够明显抑制角膜nv生长，减少nv面积，具有统计学意义(p<0.05)。康柏西普滴眼液1mg/ml、康柏西普滴眼液0.1mg/ml也能抑制角膜nv生长。而康柏西普滴眼液0.01mg/ml无抑制角膜新生血管生长作用，且nv面积大于烧伤组，但无显著性差异。见表2。表2各药物对碱烧伤致兔眼角膜nv的影响注：buffer对照，*p<0.05,**p<0.01。实施例3、康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制备处方：fp3融合蛋白10mg/ml、9mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml制备方法：将浓缩换液后的fp3融合蛋白原液化冻后，在c级洁净去洁净台(无菌柜)中，按无菌操作法加入过滤除菌的含有55mm柠檬酸、12.5％蔗糖、250mm精氨酸和0.05％吐温20的缓冲液、滤过、分别调节fp3融合蛋白至10mg/ml、9mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml，ph为7.5～8.3，无菌分装到盛装滴眼液的容器中，存放于2-8℃。实施例4、康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制备处方：fp3融合蛋白0.5mg/ml制备方法：将浓缩换液后的fp3融合蛋白原液化冻后，在c级洁净去洁净台(无菌柜)中，按无菌操作法加入过滤除菌的含有10mm柠檬酸、8.0％蔗糖、5mm精氨酸和0.05％吐温20的缓冲液，滤过、调节fp3融合蛋白至0.5mg/ml,ph为7.5～8.3，无菌分装到盛装滴眼液的容器中，存放于2-8℃。实施例5康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制备处方：制备方法：将浓缩换液后的fp3融合蛋白原液化冻后，在c级洁净去洁净台(无菌柜)中，按无菌操作法加入过滤除菌的含有100mm柠檬酸、20.0％蔗糖、250mm精氨酸和0.10％吐温20的缓冲液，滤过，调节fp3融合蛋白至1.0mg/ml,ph为7.5～8.3无菌分装到盛装滴眼液的容器中，存放于2-8℃。实施例6康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制备处方：制备方法：将浓缩换液后的fp3融合蛋白原液化冻后，在c级洁净去洁净台(无菌柜)中，按无菌操作法加入过滤除菌的含有5mm磷酸二氢钠、10.0％海藻糖、100mm精氨酸和0.01％peg400的缓冲液，滤过，调节fp3融合蛋白至0.1mg/ml,ph为7.5～8.3，无菌分装到盛装滴眼液的容器中，存放于2-8℃。实施例7康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制备处方：制备方法：将浓缩换液后的fp3融合蛋白原液化冻后，在c级洁净去洁净台(无菌柜)中，按无菌操作法加入过滤除菌的含有5mm柠檬酸、4.0％蔗糖、4.0％氯化钠、100mm精氨酸、100mm组氨酸、0.05％吐温20、0.05％peg400的缓冲液，滤过，调节fp3融合蛋白至0.05mg/ml、ph为7.5～8.3，无菌分装到盛装滴眼液的容器中，存放于2-8℃。实施例8康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制备处方：制备方法：将浓缩换液后的fp3融合蛋白原液化冻后，在c级洁净去洁净台(无菌柜)中，按无菌操作法加入过滤除菌的含有10mm柠檬酸、30.0％蔗糖、500mm精氨酸、0.1％吐温20的缓冲液，滤过，调节fp3融合蛋白至5.0mg/ml、ph为7.5～8.3，无菌分装到盛装滴眼液的容器中，存放于2-8℃。实施例9康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制备处方：制备方法：将浓缩换液后的fp3融合蛋白原液化冻后，在c级洁净去洁净台(无菌柜)中，按无菌操作法加入过滤除菌的含有10mm柠檬酸、5.0％蔗糖、100mm精氨酸、0.05％吐温20的缓冲液、滤过，调节fp3融合蛋白至0.5mg/ml、ph为7.5～8.3，无菌分装到盛装滴眼液的容器中，存放于2-8℃。实施例10康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制备处方：制备方法：将浓缩换液后的fp3融合蛋白原液化冻后，在c级洁净去洁净台(无菌柜)中，按无菌操作法加入过滤除菌的含有250mm柠檬酸、8.0％蔗糖、100mm组氨酸、0.10％吐温20的缓冲液、滤过，调节fp3融合蛋白至0.5mg/ml、ph为7.5～8.3，无菌分装到盛装滴眼液的容器中，存放于2-8℃。实施例13康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制备处方：制备方法：将浓缩换液后的fp3融合蛋白原液化冻后，在c级洁净去洁净台(无菌柜)中，按无菌操作法加入过滤除菌的含有10mm柠檬酸、5.0％蔗糖、100mm精氨酸、0.05％吐温20的缓冲液、滤过，调节fp3融合蛋白至0.5mg/ml、ph为7.5～8.3，无菌分装到盛装滴眼液的容器中，存放于2-8℃。实施例14系列融合蛋白滴眼液的制备处方：制备方法：将浓缩换液后的各种融合蛋白(fp1、fp2、fp4、fp5、fp6、fp7、fp8)原液化冻后，在c级洁净去洁净台(无菌柜)中，按无菌操作法加入过滤除菌的含有55mm柠檬酸、12.5％蔗糖、250mm精氨酸和0.05％吐温20的缓冲液、过滤，分别调节融合蛋白至9mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml或0.05mg/ml，ph为6.0～8.3,无菌分装到盛装滴眼液的容器中，存放于2-8℃。实施例15fp1融合蛋白滴眼液的制备处方：制备方法：将浓缩换液后的fp1融合蛋白原液化冻后，在c级洁净去洁净台(无菌柜)中，按无菌操作法加入过滤除菌的含有5mm磷酸、5mm柠檬酸、100mm氯化钠和0.005％吐温20的缓冲液、滤过，调节融合蛋白至1.0mg/ml，ph为6.0-8.0，无菌分装到盛装滴眼液的容器中，存放于2-8℃。实施例16不含康柏西普(fp3融合蛋白)的制剂缓冲液制备处方：制备方法：将按无菌操作法加入过滤除菌的含有55mm柠檬酸、12.5％蔗糖、250mm精氨酸和0.05％吐温20的缓冲液、滤过、分别调节ph为7.5～8.3，无菌分装到盛装滴眼液的容器中，存放于2-8℃。实施例170.1mg/ml康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液在25℃的稳定性1、按照实施例3制备0.1mg/ml康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液2、将上述0.1mg/ml康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液，25℃留样，在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12月测定样品，通过sec-hplc确定稳定性。结果显示，该处方能有效抑制聚合物的生成，产品纯度基本不下降，融合蛋白与vegf的亲和力几乎不变。具体结果见表3。表3.0.1mg/mlfp3融合蛋白在25℃的稳定性时间(月)外观ph值聚合物(％)亲和力(pm)0合格7.20.0110.61合格7.40.0310.52合格7.50.0310.43合格7.50.0510.46合格7.70.0710.29合格7.60.0810.312合格7.50.0910.1实施例1810mg/ml康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液在4℃的稳定性1、按照实施例3制备10mg/ml康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液2、将上述10mg/ml康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液，4℃留样，在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12月测定样品，通过sec-hplc确定稳定性。结果显示，该处方能有效抑制聚合物的生成，产品中聚合物增加缓慢，融合蛋白与vegf的亲和力几乎不变。具体结果见表4。表4.10mg/mlfp3融合蛋白在4℃的稳定性sequencelisting<110>成都康弘生物科技有限公司<120>一种含有vegf拮抗剂的滴眼液<130>zl200610066257.2<160>9<170>patentinversion3.3<210>1<211>93<212>prt<213>flt-1d2<400>1prophevalglumettyrsergluileprogluileilehismetthr151015gluglyarggluleuvalileprocysargvalthrserproasnile202530thrvalthrleulyslyspheproleuaspthrleuileproaspgly354045lysargileiletrpaspserarglysglypheileileserasnala505560thrtyrlysgluileglyleuleuthrcysglualathrvalasngly65707580hisleutyrlysthrasntyrleuthrhisargglnthr8590<210>2<211>96<212>prt<213>flt-1d4<400>2pheilethrvallyshisarglysglnglnvalleugluthrvalala151015glylysargsertyrargleusermetlysvallysalapheproser202530progluvalvaltrpleulysaspglyleuproalathrglulysser354045alaargtyrleuthrargglytyrserleuileilelysaspvalthr505560glugluaspalaglyasntyrthrileleuleuserilelysglnser65707580asnvalphelysasnleuthralathrleuilevalasnvallyspro859095<210>3<211>86<212>prt<213>kdrd1<400>3proargleuserileglnlysaspileleuthrilelysalaasnthr151015thrleuglnilethrcysargglyglnargaspleuasptrpleutrp202530proasnasnglnserglysergluglnargvalgluvalthrglucys354045seraspglyleuphecyslysthrleuthrileprolysvalilegly505560asnaspthrglyalatyrlyscysphetyrarggluthraspleuala65707580servaliletyrvaltyr85<210>4<211>102<212>prt<213>kdrd3<400>4valvalleuserproserhisglyileileglugluleuservalgly151015glulysleuvalleuasncysthralaargthrgluleuasnvalgly202530ileasppheasntrpglutyrproserserlyshisglnhislyslys354045leuvalasnargaspleulysthrglnserglyserglumetlyslys505560pheleuserthrleuthrileaspglyvalthrargseraspglngly65707580leutyrthrcysalaalaserserglyleumetthrlyslysasnser859095thrphevalargvalhis100<210>5<211>92<212>prt<213>kdrd4<400>5phevalalapheglyserglymetgluserleuvalglualathrval151015glygluargvalargileproalalystyrleuglytyrpropropro202530gluilelystrptyrlysasnglyileproleugluserasnhisthr354045ilelysalaglyhisvalleuthrilemetgluvalsergluargasp505560thrglyasntyrthrvalileleuthrasnproileserlysglulys65707580glnserhisvalvalserleuvalvaltyrvalpro8590<210>6<211>552<212>prt<213>人工序列<400>6metvalsertyrtrpaspthrglyvalleuleucysalaleuleuser151015cysleuleuleuthrglyserserserglyglyargprophevalglu202530mettyrsergluileprogluileilehismetthrgluglyargglu354045leuvalileprocysargvalthrserproasnilethrvalthrleu505560lyslyspheproleuaspthrleuileproaspglylysargileile65707580trpaspserarglysglypheileileserasnalathrtyrlysglu859095ileglyleuleuthrcysglualathrvalasnglyhisleutyrlys100105110thrasntyrleuthrhisargglnthrasnthrileileaspvalval115120125leuserproserhisglyilegluleuservalglyglulysleuval130135140leuasncysthralaargthrgluleuasnvalglyileasppheasn145150155160trpglutyrproserserlyshisglnhislyslysleuvalasnarg165170175aspleulysthrglnserglyserglumetlyslyspheleuserthr180185190leuthrileaspglyvalthrargseraspglnglyleutyrthrcys195200205alaalaserserglyleumetthrlyslysasnserthrphevalarg210215220valhisglulysprophevalalapheglyserglymetgluserleu225230235240valglualathrvalglygluargvalargleuproalalystyrleu245250255glytyrproproprogluilelystrptyrlysasnglyileproleu260265270gluserasnhisthrilelysalaglyhisvalleuthrilemetglu275280285valsergluargaspthrglyasntyrthrvalileleuthrasnpro290295300ileserlysglulysglnserhisvalvalserleuvalvaltyrval305310315320proproglyproglyasplysthrhisthrcysproleucysproala325330335progluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro340345350lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval355360365valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval370375380aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln385390395400tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln405410415asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala420425430leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro435440445arggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthr450455460lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser465470475480aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr485490495lysalathrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr500505510serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe515520525sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys530535540serleuserleuserproglylys545550<210>7<211>455<212>prt<213>人工序列<400>7metvalsertyrtrpaspthrglyvalleuleucysalaleuleuser151015cysleuleuleuthrglyserserserglyglyargprophevalglu202530mettyrsergluileprogluileilehismetthrgluglyargglu354045leuvalileprocysargvalthrserproasnilethrvalthrleu505560lyslyspheproleuaspthrleuileproaspglylysargileile65707580trpaspserarglysglypheileileserasnalathrtyrlysglu859095ileglyleuleuthrcysglualathrvalasnglyhisleutyrlys100105110thrasntyrleuthrhisargglnthrasnthrileileaspvalval115120125leuserproserhisglyilegluleuservalglyglulysleuval130135140leuasncysthralaargthrgluleuasnvalglyileasppheasn145150155160trpglutyrproserserlyshisglnhislyslysleuvalasnarg165170175aspleulysthrglnserglyserglumetlyslyspheleuserthr180185190leuthrileaspglyvalthrargseraspglnglyleutyrthrcys195200205alaalaserserglyleumetthrlyslysasnserthrphevalarg210215220valhisglulysasplysthrhisthrcysproleucysproalapro22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