PHB2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别地，涉及一种phb2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用。

背景技术：

猪圆环病毒(porcinecircovirus，pcv)属于圆环病毒科圆环病毒属，是无囊膜的环状单链dna病毒(直径17nm)。目前在猪群中已鉴定出pcv1、pcv2和pcv3。其中，pcv2临床或亚临床感染被认为是猪圆环病毒病(porcinecircovirusdiseasesandporcinecircovirus-associateddiseases，pcvd/pcvad)的主要原因，pcvd/pcvad传染性强、流行范围广，不同猪(群或场)的pcvad发病率和严重程度存在差异，该疾病日趋复杂，其代表性特征主要是猪皮炎和肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysyndrome，pdns)、断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaningmultisystemicwastingsyndrome，pmws)以及猪呼吸系统疾病综合征(porcinerespiratorydiseasecomplex，prdc)，还可引起繁殖障碍等，严重危害全球养殖业。pcv2cap蛋白(capsidprotein)是pcv2唯一的核衣壳蛋白，也是主要免疫原性蛋白，基于pcv2cap蛋白组装的病毒样颗粒(virus-likeparticles，vlps)亚单位疫苗可应用于猪场pcv2的预防。

迄今为止，pcvd/pcvad的确切机制还有待阐明，加上临床上pcv2基因组的高突变率和混合感染问题日益严重，使防控pcv2流行面临严峻挑战。shuang等在研究泛素-蛋白酶体系统(ups)与pcv2复制的互作时发现，其蛋白酶体抑制剂(mg132和lactacystin)显著降低pcv2早期复制滴度，ups可能以细胞周期依赖的方式降低病毒蛋白表达和rna转录，表明pcv2复制效率与ups密切相关。liu等利用hsp90抑制剂(17-aag)腹腔注射小鼠后发现，17-aag能够显著降低血液和组织中pcv2病毒载量，可降低pcv2感染小鼠血液和组织中的病毒载量，表明hsp90与pcv2复制密切相关。wang等研究发现波形蛋白(vimentin)可以与pcv2cap蛋白之间的相互作用，并对pcv2在pk-15细胞中的复制有一定的抑制作用。目前pcv2感染与宿主细胞之间的相互作用网络还不是十分清楚，而pcv2与宿主细胞内蛋白分子互作的研究报道相对较少。

抗增殖蛋白(prohibitins，phbs)是一种高度保守和结构非常稳定的蛋白质家族(包括phb1和phb2等)，phbs广泛分布于各种生物细胞，呈现不同细胞定位，主要存在于线粒体内膜，也少量分布于细胞质膜和细胞核。phbs是细胞中重要的多功能蛋白，直接参与调控细胞增殖、凋亡和分化等多种细胞生物学进程，与肿瘤、糖尿病和肥胖症等疾病密切相关。而phb2是phbs家族中的重要成员，是线粒体与细胞核间相互交流的重要媒介。

技术实现要素：

本发明提供了一种phb2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用，解决如何抑制猪圆环病毒2型的复制的技术问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种phb2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用。

进一步地，抑制剂选择以能够抑制phb2蛋白表达或基因转录的小干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)、短发夹rna(shrna)或反义寡核苷酸；或能表达或形成sirna、dsrna、shrna或反义寡核苷酸的构建物。

进一步地，sirna包括phb2sirna-1或phb2sirna-2；phb2sirna-1的靶序列如seqidno：1所示，或者，phb2sirna-2的靶序列如seqidno：2所示。

进一步地，shrna的编码序列正义链如seqidno：3所示，反义链如seqidno：4所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种抑制猪圆环病毒2型的sirna的靶序列，sirna包括phb2sirna-1或phb2sirna-2；phb2sirna-1的靶序列如seqidno：1所示，或者，phb2sirna-2的靶序列如seqidno：2所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种抑制猪圆环病毒2型的shrna分子，shrna分子的编码序列正义链如seqidno：3所示，反义链如seqidno：4所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种含有上述抑制猪圆环病毒2型的shrna分子的shrna表达质粒。

根据本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物，包括上述sirna的靶序列、shrna分子、shrna表达质粒中的一种，还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。

根据本发明的另一方面，还提供了一种用于抑制猪圆环病毒2型复制的试剂盒，包括上述sirna的靶序列、上述shrna分子、上述shrna表达质粒中的一种。

本发明具有以下有益效果：

本发明的phb2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用，通过间接免疫荧光试验检测pcv2在pk-15细胞中的增殖变化，检测pcv2感染pk-15细胞后phb2mrna的动态变化，和鉴定在phb2基因或蛋白的抑制剂转染pk-15细胞中pcv2cap蛋白表达。结果表明，phb2在正常及pcv2感染的pk-15细胞中均有效表达。pcv2可显著影响pk-15细胞中phb2转录，而且phb2对pcv2病毒复制具有调节作用，下调phb2的表达，即phb2基因敲除或蛋白表达下调，能明显抑制pcv2的复制，对阐明pcv2致病机理和研究新的抗病毒药物具有重要意义。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明的pcv2在pk-15细胞中的增殖情况示意图；

图2是本发明的gc1qr和phb2荧光定量pcr引物溶解曲线图；

图3是本发明的gc1qr和phb2荧光定量pcr扩增曲线图；

图4是本发明的pcv2感染pk-15细胞后gc1qr基因mrna水平的变化结果示意图；

图5是本发明的pcv2感染pk-15细胞后phb2基因mrna水平的变化结果示意图；

图6是本发明的sirna转染pk-15细胞后phb2基因mrna水平的变化结果示意图；

图7是本发明的sirna转染pk-15细胞后pcv2cap蛋白westernblot鉴定图；

图8是本发明的sirna转染pk-15细胞后pcv2cap蛋白的变化结果示意图；

图9是本发明的sirna转染pk-15细胞后ifa检测结果图；

图10是本发明的shrna设计示意图；

图11是本发明的shrna转染pk-15细胞后phb2基因mrna水平的变化结果示意图；以及

图12是本发明的shrna转染pk-15细胞后pcv2cap蛋白的变化结果示意图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本实施例中，一种phb2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用。本发明的phb2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用，通过间接免疫荧光试验检测pcv2在pk-15细胞中的增殖变化，检测pcv2感染pk-15细胞后phb2mrna的动态变化，和鉴定在phb2基因或蛋白的抑制剂转染pk-15细胞中pcv2cap蛋白表达。结果表明，phb2在正常及pcv2感染的pk-15细胞中均有效表达。pcv2可显著影响pk-15细胞中phb2转录，而且phb2对pcv2病毒复制具有调节作用，下调phb2的表达，即phb2基因敲除或蛋白表达下调，能明显抑制pcv2的复制，对阐明pcv2致病机理和研究新的抗病毒药物具有重要意义。

基于genbank库中猪phb2基因序列(geneid：100627467)，设计并合成引物，引物f1(forwardprimer)如seqidno：5所示，具体的：ctgccctccattgtcaacga，引物r1(reverseprimer)如seqidno：6所示，具体的：cagctcccttcggatcaaca；并以tbp作为内参基因，依据tbp基因序列(geneid：110259740)，设计并合成引物，引物f2(forwardprimer)如seqidno：7所示，具体的：gatggacgttcggtttagg，引物r2(reverseprimer)如seqidno：8所示，具体的：agcagcacagtacgagcaa；提取具有pcv2感染的pk-15细胞的cdna，以cdna为模板，进行pcr扩增，检测phb2在pcv2感染的pk-15细胞中mrna动态变化。在pcv2感染的作用下，pk-15细胞中phb2mrna转录水平升高，在感染后6h内，phb2mrna转录水平逐渐上升，且呈现时间相关性，在感染后6h时显著升高，是对照组的4.08倍(p<0.01)，且达到了最高水平。说明pcv2感染对细胞宿主因子phb2mrna转录的影响。经过前期的试验研究发现将pcv2病毒样颗粒(virus-likeparticles，vlps)侵染猪肺泡巨噬细胞(3d4/2细胞系)，利用免疫共沉淀联合质谱方法发现，phb2是pcv2vlps候选细胞互作蛋白之一，提示该蛋白可能参与了pcv2细胞入侵和复制，因此进一步探究phb2在pcv2感染细胞过程中发挥的作用。

本实施例中，抑制剂选择为能够抑制phb2蛋白表达或基因转录的小干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)、短发夹rna(shrna)或反义寡核苷酸；或能表达或形成sirna、dsrna、shrna或反义寡核苷酸的构建物。

本实施例中，sirna包括phb2sirna-1或phb2sirna-2。phb2sirna-1的靶序列如seqidno：1所示，或者，phb2sirna-2的靶序列如seqidno：2所示。将phb2sirna-1、phb2sirna-2的干扰片段转染pk-15细胞，并检测phb2基因变化，phb2sirna-1和phb2sirna-2都可以抑制phb2在pk-15细胞中mrna的转录水平。优选地，sirna选择phb2sirna-2，其敲除效率最高(71％)。将pcv2接种转染phb2sirna-1或phb2sirna-2后的pk-15细胞，并进行培养。检测结果显示，pcv2cap蛋白水平均显著降低。说明phb2基因敲除或蛋白表达下调，能明显抑制pcv2复制，指示phb2sirna-1和phb2sirna-2均能抑制pcv2复制。phb2sirna-1的靶序列具体为5′-ccaucacugagcugagcuu-3′。phb2sirna-2的靶序列具体为5′-ccaguacccuaucaucuau-3′。

本实施例中，shrna的编码序列正义链如seqidno：3所示，反义链如seqidno：4所示。通过已选的靶点序列设计shrna干扰序列，获得上述shrna的编码序列正义链和反义链，并合成双链dnaoligo(简称dsoligo)，将dsoligo与线性化载体连接，转化大肠杆菌dh5α中获得菌液，提取质粒获得shrna表达质粒。线性化载体采用pentrtm/u6。shrna的编码序列正义链具体为5'-caccg*ccagtaccctatcatctatcgaaatagatgatagggtactgg-3'，shrna的编码序列反义链具体为5'-aaaaccagtaccctatcatctatttcgatagatgatagggtactggc*-3'。

根据本发明的另一方面，还提供了一种抑制猪圆环病毒2型的sirna的靶序列，sirna包括phb2sirna-1或phb2sirna-2；phb2sirna-1的靶序列如seqidno：1所示，或者，phb2sirna-2的靶序列如seqidno：2所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种抑制猪圆环病毒2型的shrna分子，shrna分子的编码序列正义链如seqidno：3所示，反义链如seqidno：4所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种含有上述抑制猪圆环病毒2型的shrna分子的shrna表达质粒。

根据本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物，包括上述sirna的靶序列、shrna分子、shrna表达质粒中的一种，还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。在制备这些药物组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以以胶囊或药囊形式存在的载体中。用于预防或治疗由pcv2感染导致的疾病。

根据本发明的另一方面，还提供了一种用于抑制猪圆环病毒2型复制的试剂盒，包括sirna的靶序列、shrna分子、shrna表达质粒中的一种。

实施例

病毒pcv2d毒株，genbank登录号：kj867555，其tcid50为1×10^5.66/ml，本实验室保存。

猪肾上皮细胞(pk-15)，本实验室保存。

兔源性抗pcv2cap多克隆抗体，本实验室保存；异硫氰酸荧光素(fitc)偶联的驴抗兔igg抗体，购自lifetechnologies公司；过氧化物酶(hrp)标记的羊抗兔igg抗体，购自kpl公司。

trizolreagent和lipofectaminetm2000转染试剂，购自invitrogen公司。

m-mlv反转录酶及相关试剂盒，购自promega公司。

easytaqdna聚合酶，购自北京全式金生物公司。

qpcrgreenmastermix，购自广州唯赞生物公司。

dmem细胞培养基及小牛血清，购自gibco公司。

其他相关试剂均为国产分析纯。

实验数据以平均数±标准差(mean±sd)表示，利用spssstatistics22.0软件中的单因素方差分析(one-wayanova)法，对结果进行分析。0.01＜p＜0.05为差异显著，用*标示；p＜0.01为差异极显著，用**标示。

实施例1

1.1pcv2d感染pk-15细胞

将无pcv1/pcv2污染的pk-15细胞接种于6孔细胞培养板中，用含10％nbcs(新生牛血清)的dmem培养基培养细胞，至细胞融合率为60％。用tcid50＝1×10^5.66/ml的pcv2d感染pk-15细胞后，分别于3、6、12、24和48h收集各孔细胞，作为实验组；不做任何处理的细胞标记为0h，作为对照组，每个时间点设置3个复孔。

1.2间接免疫荧光法检测pcv2在pk-15细胞中的增殖

利用上述方法将pcv2d感染pk-15细胞后，分别于0.5、1、12、24和36h用4％多聚甲醛固定细胞20min，再用含0.1％tritonx-100的pbs透化处理细胞10min，pbs洗3次后在含3％bsa(小牛血清白蛋白)的pbs中封闭1h。以兔源性抗pcv2cap的多克隆抗体作为一抗室温孵育1h，fitc标记的驴抗兔igg的抗体作为二抗室温避光孵育1h，于荧光倒置显微镜下观察，以上每两步骤间用pbs洗3次，每次5min。

1.3细胞rna提取及其反转录

利用细胞rna提取试剂盒(trizol法)对上述收集的细胞进行总rna提取。取2ulrna样品，利用nanodrop分光光度计测定rna浓度及纯度(d260nm/280nm比值)。取1ug细胞总rna，利用m-mlvfirststrandcdnasynthesiskit试剂盒反转录合成cdna。

1.4pcv2感染pk-15细胞中phb2mrna水平的检测

基于genbank库中猪phb2基因序列(geneid：100627467)，设计并合成引物，引物f1(forwardprimer)如seqidno：5所示，引物r1(reverseprimer)如seqidno：6所示；并以tbp作为内参基因，依据tbp基因序列(geneid：110259740)，设计并合成引物，引物f2(forwardprimer)如seqidno：7所示，引物r2(reverseprimer)如seqidno：8所示；以cdna为模板，利用aceqqpcrgreenmastermix试剂盒进行sybrgreen荧光定量pcr扩增，检测phb2在pcv2感染的pk-15细胞中mrna动态变化，反应条件为：95℃，5min；95℃，10s，60℃，30s，重复40个循环；最后为溶解曲线设置阶段，95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s。

对比例1

对比例1的步骤与实施例1的步骤相同，区别在于：基于genbank库中猪gc1qr基因序列(geneid：110256103)，设计并合成引物，引物f3(forwardprimer)如seqidno：9所示，具体的actcccaacttcgtggttgaag，引物r3(reverseprimer)如seqidno：10所示；具体的cctcgtcctcttgtccaatctc。

检测结果如下所示：

图1是本发明的pcv2在pk-15细胞中的增殖情况示意图。

图2是本发明的gc1qr和phb2荧光定量pcr引物溶解曲线图。

图3是本发明的gc1qr和phb2荧光定量pcr扩增曲线图。

图4是本发明的pcv2感染pk-15细胞后gc1qr基因mrna水平的变化结果示意图。

图5是本发明的pcv2感染pk-15细胞后phb2基因mrna水平的变化结果示意图。

如图1所示，pcv2感染pk-15细胞后，随着时间的推移(0h～36h)，pk-15细胞中特异性的荧光信号(pcv2)数量不断增多，荧光强度不断增强，且大部分荧光信号由点状分布于细胞膜周边(0.5h～1h)，逐渐聚集在细胞质和细胞核(12h～24h)，最后到感染后36h时，pcv2阳性信号均聚集在细胞核。结果表明pcv2在1h内完成入侵，随后在pk-15细胞中不断增殖。

如图2和图3所示，通过荧光定量pcr对不同样品进行分析，gc1qr引物和phb2引物的溶解曲线均峰值集中无杂带，显示出单一峰，同时扩增曲线清晰，平台期稳定，表明检测方法具有较好的准确性和敏感性。

如图4和图5所示，在pcv2感染的作用下，pk-15细胞中phb2mrna转录水平(除了24h外)均升高，在感染后6h内，phb2mrna转录水平逐渐上升，且呈现时间相关性，在感染后6h时显著升高，是对照组的4.08倍(p<0.01)，且达到了最高水平。而后随着时间的推移，phb2mrna表达呈下降趋势。而gc1qrmrna转录水平在病毒感染6h时升高，是对照组的1.25倍，而随着时间(12h、24h和48h)转录水平下降，尽管在48h又再次升高，但仍低于对照组。因此，通过实施例1与对比例1的检测可知，并非所有蛋白在pcv2感染的作用下，pk-15细胞中的mrna转录都会提高，本发明则是pcv2特异性的促进phb2在pk-15细胞中phb2mrna转录水平。

实施例2

pk-15细胞长成单层后转染靶向phb2基因的rna干扰片段。干扰片段是phb2sirna-1，phb2sirna-1的靶序列如seqidno：1所示，转染pk-15细胞。qpcr用于检测phb2基因的rna干扰效率。转染24h后弃培养基，pbs洗涤3次后，用pcv2侵染细胞1h后弃培养基，pbs洗涤3次后，换新鲜培养基继续培养48h。裂解细胞计算蛋白浓度后，以β-actin作为内参，分别以抗β-actin(鼠源)和兔源性抗pcv2cap的多克隆抗体作为一抗，以对应的hrp标记的抗鼠和抗兔抗体作为二抗，进行westernblot试验，检测pcv2cap蛋白的变化。

实施例3

pk-15细胞长成单层后转染靶向phb2基因的rna干扰片段。干扰片段是phb2sirna-2，phb2sirna-2的靶序列如seqidno：2所示，转染pk-15细胞。qpcr用于检测phb2基因的rna干扰效率。转染24h后弃培养基，pbs洗涤3次后，用pcv2侵染细胞1h后弃培养基，pbs洗涤3次后，换新鲜培养基继续培养48h。裂解细胞计算蛋白浓度后，以β-actin作为内参，分别以抗β-actin(鼠源)和兔源性抗pcv2cap的多克隆抗体作为一抗，以对应的hrp标记的抗鼠和抗兔抗体作为二抗，进行westernblot试验，检测pcv2cap蛋白的变化。并采用ifa测试方法检测pcv2在pk-15细胞中的增殖，其操作方法与实施例1的1.2步骤相似。

对比例2

无关干扰片段sirna-nc作为对照，sirna-nc的靶序列如seqidno：11所示，具体的：5′-uucuccgaacgugucacgu-3′。其他步骤与实施例2相同。

检测结果如下所示：

图6是本发明的sirna转染pk-15细胞后phb2基因mrna水平的变化结果示意图。

图7是本发明的westernblot鉴定图；泳道1：无关干扰片段sirna-nc；泳道2：干扰片段phb2sirna-1；泳道3：干扰片段phb2sirna-2；cap代表pcv2cap蛋白，β-actin为内参蛋白。

图8是本发明的sirna转染pk-15细胞后pcv2cap蛋白的变化结果示意图。

图9是本发明的sirna转染pk-15细胞后pcv2的ifa检测结果图；1：sirna-nc；2：phb2sirna-2。

如图6所示，为了验证phb2与pcv2复制间的关系，phb2sirna-1、phb2sirna-2及无关干扰片段sirna-nc为对照转染pk-15细胞，qpcr检测phb2基因变化，结果显示phb2sirna-1和phb2sirna-2都可以抑制phb2在pk-15细胞中mrna的转录水平。其中，phb2sirna-2的敲除效率最高(71％)，可以明显抑制phb2在pk-15细胞中mrna的转录水平(0.01<p<0.05)。

如图7、图8和图9所示，sirna转染24h后，接种pcv2培养48h，westernbot鉴定结果显示，phb2sirna-2干扰组中pcv2cap蛋白水平显著低于对照组，约低于sirna-nc的25％(0.01<p<0.05)。并且ifa结果表明，与对比例2的sirna-nc相比，phb2sirna-2的使用能导致荧光信号(代表pcv2)减少，说明phb2基因的沉默能抑制pcv2复制。

实施例4

4.1shrna预处理

如图10所示，通过phb2sirna-2靶点序列设计shrna序列，shrna的编码序列正义链(简称topstrandoligo)如seqidno：3所示，反义链(简称bottomstrandoligo)如seqidno：4所示。shrna由公司合成。其中，caccg*与aaaa代表loop序列。

反应体系(20μl)如下：5μltopstrandoligo(200μm)，5μlbottomstrandoligo(200μm)，2μl10×oligoannealingbuffer(100mmtris-hcl,10mmedta,1mnaclph8.0)，8μldnase/rnase-freewater。分别将20μl体系的pcr管于95℃4min，室温10min，获得dsoligo产物，用dnase/rnase-freewater稀释产物(1μl)100倍，再分别取10μl10×oligoannealingbuffer和89μldnase/rnase-freewater与1μl稀释后的产物混匀，获得稀释后的产物浓度(5nm)。

4.2shrna表达质粒的构建

反应体系(20μl)：4μl5×ligationbuffer，2μlpentrtm/u6，2μldsoligo(5nm)，2μldnase/rnase-freewater，1μlt4dnaligase。反应体系室温放置6min。然后反应产物(2μl)加入大肠杆菌(dh5α)中，经过热激(42℃)1min、冰上放置6min后，加入300μlsoc培养基，然后37℃培养1h。取50μl转化菌液涂布在lb培养板中于37℃培养12h，再将单克隆菌落至lb培养基中培养12h。按质粒提取试剂盒的说明书提取质粒。

4.3shrna表达质粒抑制pcv2

将shrna表达质粒转染pk-15细胞，qpcr用于检测phb2基因的rna干扰效率。转染24h后弃培养基，pbs洗涤3次后，用pcv2侵染细胞1h后弃培养基，pbs洗涤3次后，换新鲜培养基继续培养至48h。westernblot检测pcv2cap蛋白表达量的变化。

检测结果如下所示：

图10是本发明的shrna设计示意图；

图11是本发明的shrna转染pk-15细胞后phb2基因mrna水平的变化结果示意图，shrna-nc代表对照组，即为空载体；

图12是本发明的shrna转染pk-15细胞后pcv2cap蛋白表达量变化的结果示意图，shrna-nc代表对照组，即为空载体。

如图11所示，shrna和空载体转染pk-15细胞，qpcr检测phb2基因变化，结果显示shrna可以明显抑制phb2在pk-15细胞中mrna的转录水平(0.01<p<0.05)。

如图12所示，shrna和空载体转染24h后，接种pcv2培养48h，westernbot鉴定结果显示，shrna干扰组中pcv2cap蛋白水平显著低于对照组(0.01<p<0.05)。与相应的phb2sirna抑制pcv2复制的结果相似(如图9)，说明shrna-2同样能抑制pcv2复制。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖南农业大学

<120>phb2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccaucacugagcugagcuu19

<210>2

<211>19

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccaguacccuaucaucuau19

<210>3

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caccgccagtaccctatcatctatcgaaatagatgatagggtactgg47

<210>4

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aaaaccagtaccctatcatctatttcgatagatgatagggtactggc47

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ctgccctccattgtcaacga20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cagctcccttcggatcaaca20

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gatggacgttcggtttagg19

<210>8

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

agcagcacagtacgagcaa19

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

actcccaacttcgtggttgaag22

<210>10

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

cctcgtcctcttgtccaatctc22

<210>11

<211>19

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

uucuccgaacgugucacgu19