一种自组装核酸纳米管制剂及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物制剂，特别涉及一种包含SiRNA的管状核酸纳米制剂及制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 开发通用的药物载体是纳米医学最重要的研宄主题。以前的研宄已经报道了许多 药物递送系统，例如：合成的高分子聚合物、阳离子脂质体、碳纳米管、环糊精材料、纳米粒 子、病毒衣壳等。这些递送系统的有效性已被清楚的演示，然而，它们大多数都是非自然或 者外生性分子，缺乏组织特异性及具有潜在毒性。近来在DNA结构方面的研宄使得它能进 一步运用于生物学领域。DNA是人体内的自然组分，它相对稳定，且能进行生物降解，不产生 免疫原性。因此，自组装的DNA纳米结构在疾病基因治疗领域具有巨大的潜力。
[0003] 肺动脉高压（PAH)是慢性肺部疾病的严重并发症，临床疗效差，病死率高。肺血管 的异常增殖和重构是其病理基础。以前的研宄表明，肺动脉平滑肌细胞的异常增殖和凋亡 抵抗在肺高压形成中发挥关键作用，近来的研宄证实自噬对哺乳动物细胞具有强大的调控 机制。自噬在肺血管疾病发病机制中扮演关键作用。
[0004] 哺乳动物雷帕霉素蛋白（mTOR)，一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞应对生理 条件及环境压力时调控自噬及生长的关键成分。哺乳动物雷帕霉素蛋白已被证实与肿瘤 的发生、发展，心血管疾病，自身免疫性疾病，代谢紊乱和老年性疾病等多种疾病密切相关。 因此，靶标哺乳动物雷帕霉素蛋白在治疗多种疾病中提供了一种创新策略。研宄表明哺 乳动物雷帕霉素蛋白激活可以抑制自嗤，相反，抑制mTOR则诱导自嗤。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，可高效、特异地抑制革El基因翻译过程，实现革El基因的表达下调。 因此，如何设计开发临床适用的针对肺动脉高压治疗的siRNA递送系统仍然具有巨大的挑 战。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种自组装核酸纳米管制剂及制备方法和应用，该制剂使 siRNA双螺旋化，并自组装进入纳米管系统，使siRNA不易被核酸酶降解，形成复合纳米 管结构，充分发挥了纳米粒子易被细胞摄取的优点，显著增强了对细胞的转染效率。因此 siRNA进入细胞结构稳定，保持原有生物活性。该制剂对肺动脉平滑肌细胞的转染效率显著 提高，能有效调控肺动脉平滑肌细胞的自噬，抑制肺动脉平滑肌细胞的异常增殖，可用于制 备治疗肺动脉高压的药物。
[0006] 申请人发明了一种通过控制时间和温度交联四条DNA单链形成的纳米管系统，将 功能基因 mTOR siRNA通过特定的摩尔比反应绑定到纳米管结构上形成纳米复合体制剂。核 酸纳米载体由于具有较高的可编程性、较好的生物稳定性和生物相容性，不会导致细胞异 常转化或死亡，而且具有纳米粒子特殊的结构和表面电荷，能较好的被细胞摄取，并将释放 交联系统中的siRNA，使其具有较高的转染效率及生物学效应。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008] -种自组装核酸纳米管制剂，该制剂包括DNA-RNA交联构成管状的自组装纳米制 剂。
[0009] 所述的管状自组装纳米制剂由序列SEQ ID NO :1所示的mTOR siRNA、序列如SEQ ID NO :2所示的L、序列如SEQ ID NO :3所示的M、序列如SEQ ID NO :4所示的S和序列如 SEQ ID NO :5所示的S'，通过单链核酸分子碱基互补配对合成。
[0010] 所述的管状自组装纳米制剂中mTOR siRNA、L、M、S、S ^的摩尔比为 6 : 1 : 3 : 3 : 3〇
[0011]自组装核酸纳米管制剂的制备方法，有以下步骤：
[0012] 1)取mTOR siRNA、L、M、S、的冻干干粉，分别加 H2O稀释，混勾，分别得到mTOR siRNA、L、M、S、S'溶液；
[0013] 2)取L、M、S、溶液在pH 8. 0的TAE-Mg2+缓冲液中化合合成核酸纳米管溶液， 将步骤1)所得的mTOR SiRNA添加进入核酸纳米管溶液，放置30min，得到自组装核酸纳米 管制剂。
[0014] 核酸纳米管溶液的合成为：将化合溶液于95°C放置5min，65°C放置30min，50°C放 置 30min，37°C 放置 30min，然后 22°C 放置 30min。
[0015] 所述自组装核酸纳米管制剂中mTOR siRNA、L、M、S、S ^的摩尔比为 6 : I : 3 : 3 : 3〇
[0016] 自组装核酸纳米管制剂在制备治疗肺动脉高压的药物中的应用。
[0017] 本发明所述管状核酸纳米制剂分子量为1，314, 655。
[0018] 本发明所述管状核酸纳米制剂通过单链核酸分子碱基互补配对（adenine简写A， 代表腺嗓呤；cytonine简写为C，代表胞喃啶；guanine简写为G，代表鸟嗓呤；thymine简写 T，代表胸腺嘧啶；uracil简写为U代表尿嘧啶；其中A可以与T或U互补配对，G和C互补 配对）进行纳米组装。四条单链DNA合成纳米管作为骨架位于中央，SiRNA位于纳米管的两 端，单一功能性管状核酸纳米结构可靶向递送六个SiRNA的DNA纳米粒子（参见图1)。与 其它的药物运输载体相比较，自组装的装载siRNA的纳米管制剂具有以下优点：1)核酸是 生物相容性材料且易于功能化修饰，应用其作为药物载体可以降低细胞毒性。2)核酸分子 标记方法多样，对示踪研宄药物的途径和机理提供了较大的便利。3)合成过程简单，核酸的 变性和复性容易受温度的控制，其自组装具有较强的可操控性。4)裸露siRNA进入细胞容 易被核酸酶降解，自组装纳米管纳米制剂中的siRNA与DNA结合，提高siRNA稳定性，具有 一定的缓释作用；5)在管状核酸纳米制剂的基础上，具有核酸的基本性质，可以继续与目 前国内外报道的药物运输载体结合，如类脂、脂质体、合成多聚体等，有利于细胞的摄取。
[0019] 本发明所述管状核酸纳米制剂在介导SiRNA的靶向表达或递送方面具有较好的 优势，将 mTOR siRNA(SEQ ID N0:1)、L(SEQ ID N0:2)序列、M(SEQ ID N0:3)序列、S(SEQ ID NO :4)序列和V (SEQ ID NO :5)序列先交联，将siRNA包裹于纳米管纳米结构内，siRNA 与DNA单链结合，提高siRNA的稳定性，使其不易被核酸酶降解。管状纳米载体的特殊结构 和表面电荷在转染试剂的辅助作用下，较易被细胞摄取，使siRNA进入细胞发挥作用。
[0020] 本发明所述管状核酸纳米制剂，在核酸与X-tremeGENE siRNA Transfection reagent使用量降低为1比1，使用50nM纳米制剂，对肺动脉平滑肌细胞的转染效率仍然较 高，达到75%，同时证实用DNA携带siRNA可以保护siRNA生物学活性并发挥作用；申请人 通过实验，其结果表明该自组装核酸纳米材料可显著降低mTOR的mRNA和蛋白表达水平，可 增强肺动脉平滑肌细胞的自噬，从而有效抑制细胞的异常增殖。本发明所述制剂在基因研 宄和治疗中具有巨大的潜力。
[0021] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
【附图说明】
[0022] 图1管状核酸纳米制剂结构图；
[0023] 图2管状核酸纳米制剂结构原子力显微镜扫描图；
[0024] 图3管状核酸纳米制剂PAGE图；
[0025] 图4A激光共聚焦观察不同剂量转染试剂对管状核酸纳米制剂细胞摄取的影响；
[0026] 图4B IPP分析激光共聚焦观察管状核酸纳米制剂的细胞摄取；
[0027] 图4C统计分析流式细胞仪检测不同剂量转染试剂对管状核酸纳米制剂的细胞转 染效率；
[0028] 图5A激光共聚焦观察不同剂量管状核酸纳米制剂细胞转染摄取；
[0029] 图5B IPP分析激光共聚焦观察管状核酸纳米制的细胞摄取；
[0030] 图5C统计分析流式细胞仪检测不同剂量管状核酸纳米制剂转染细胞的平均荧光 密度，并与单独mTOR siRNA转染细胞的平均荧光密度进行比较；
[0031] 图6不同时间点PASSMC细胞mTOR mRNA表达水平及半定量分析；
[0032] 图7不同时间点PASMC细胞mTOR蛋白表达水平及半定量分析；
[0033] 图8不同时间点PASMC细胞LC3B及PCNA蛋白表达水平及半定量分析；
[0034] 图9检测管状核酸纳米制剂对PASMC细胞的生长抑制。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0036] 一 .材料
[0037] PASMC细胞购自美国模式培养物研宄所；
[0038] 胎