牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS)购自美国Hyclone公司；
[0039] mTOR siRNA、L、M、S、S'序列均由上海生工有限公司合成；
[0040] 0· 25%胰蛋白酶购自Hyclone公司；
[0041] 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI)购自上海江莱生物科技有限公司；
[0042] DMEM培养基、胰蛋白酶、OPTI-MEM为Gibco公司产品；
[0043] X-tremeGENE siRNA转染试剂为瑞士 Roche公司产品；
[0044] 蛋白裂解液购自美国Thermo公司；
[0045] 双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（SDS)、过硫酸镁、β -巯基乙醇购自江苏聚成精细 化工有限公司；
[0046] NaCl、KCl、TriJjI、乙酸、EDTA、乙酸镁、HCl、酚购自上海时代生物科技有限公司；
[0047] mTOR和β-actin引物由上海生工公司合成；
[0048] mTOR 和 β-actin 抗体购自 Chemicon 公司；
[0049] 羊抗鼠或羊抗兔二抗购自Amersham公司
[0050] RT-PCR试剂盒由日本Takara公司提供。
[0051] 磁力搅拌器购自英国Jenway公司。
[0052] 二甲基亚砜、MTT购自美国Sigma公司
[0053] 二·实施例
[0054] 实施例1 :管状核酸纳米制剂的合成
[0055] 将 mTOR siRNA(SEQ ID NO :1)、L(SEQ ID NO :2)、M(SEQ ID NO :3)、S(SEQ ID NO : 4)和V (SEQ ID NO :5)各序列干粉样品，分别用灭菌灭酶的去离子水稀释为0. 2 μ g/ μ 1 ; 将L、M、S、Si容液在TAE-Mg2+缓冲液（pH 8. 0)中化合，核酸纳米管（DNA纳米管）在以 下条件下自组装合成：95°C放置5min，65°C放置30min，50°C放置30min，37°C放置30min， 然后22°C放置30min。随后将确定剂量的mTOR siRNA添加进入纳米管溶液，再次放置 3〇!1^11。得到500以1管状纳米管制剂溶液。该制剂中1111'(?8丨1?隱、1^』、5、5 /的摩尔比为 6 : 1 : 3 : 3 : 3,可用于作为治疗肺动脉高压的药物。
[0056] 管状核酸纳米制剂结构的原子力显微镜扫描图见图2 ;
[0057] 将合成的少量样品在6%非变性PAGE胶中冰浴（4°C )下电泳，通过凝胶呈像系统 扫描图片，管状核酸纳米制剂电泳图片见图3。
[0058] 经image J图像分析软件分析，结果显示管状核酸纳米制剂的条带含量约占 88. 9%，具有较高的纯度。
[0059] 实施例2 :不同剂量转染试剂对管状核酸纳米制剂转染的影响
[0060] 将处于对数生长期的PASMC用0. 25%胰蛋白酶消化，细胞爬片，细胞接种于24孔 板内（内置盖玻片），置于37°C、5% CO2孵箱中培养48小时后，待细胞密度达50%?60% 时即可用于转染；实验分组为：管状核酸纳米制剂（50nM) :X-tremeGENE siRNA的比例分别 为1 : 0、1 : 0. 25、1 : 0. 5、1 : 1和1 : 2,将携带mTOR siRNA的DNA纳米管纳米制剂 按照X-tremeGENE siRNA转染试剂说明书进行转染；转染纳米制剂后置于37°C、5% 0)2孵 箱中培养24小时。之后，将24孔板培养基弃掉，用37°C PBS轻轻漂洗3minX3次；沿着培 养板壁加入4%多聚甲醛lml，室温固定5分钟；PBS冲洗5minX 3次，弃去PBS液体；加入 60 μ I DAPI染液，室温固定3分钟；PBS冲洗5minX5次，弃去PBS液体；取出盖玻片，使用 抗淬灭封片剂（约10 μ 1)封片，避光保存；激光共聚焦显微镜下照相，利用IPP软件对荧光 强度进行定量分析。
[0061] 流式细胞术检测转染效率。转染后并孵育24小时，收集细胞，用PBS清洗贴壁细 胞2遍后弃去液体；加入0. 25%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞逐 渐变圆变亮时，吸弃胰蛋白酶，加入培养基终止消化，用滴管反复地轻轻吹打贴壁细胞，制 成单细胞悬液；lOOOrpm，离心10分钟，弃上清，每个样本中加入Iml PBS缓冲液吹打重悬细 胞，重复此步骤一次；采用激光光源为氩离子气体激光器，激发波长为530nm，运用Beckman 公司流式细胞仪检测，软件分析细胞转染效率，每组实验重复3次。
[0062] 由激光共聚焦图4A和图4B，DNA纳米管携带的Cy3-mT0R siRNA在细胞中呈红色 荧光分布，细胞摄取纳米管制剂的量伴随着转染试剂X-tremeGENE siRNA的增加而升高。 类似的，流式细胞仪检测结果（见图4C)也有相同的趋势，在核酸纳米制剂与X-tremeGENE siRNA的比例为I : 1时，转染效率达到了 75. 8%。
[0063] 实施例3 :不同剂量管状核酸纳米制剂对细胞转染的影响
[0064] 设计管状核酸纳米制剂的浓度分组为0nM、12. 5nM、25nM、50nM和IOOnM五个浓度， 激光共聚焦观察时设单独的Cy3-mTOR SiRN浓度为12. 5nM为对照组，在流式细胞术检测时 每个浓度均以单独的Cy3-mTOR siRNA作为对照，并设空白对照组。其激光共聚焦观察细胞 转染效率实验和流式细胞仪检测平均荧光密度的实验操作与实施例2相同。
[0065] 由激光共聚焦图5A和图5B，管状核酸纳米载体携带的Cy3-mTOR siRNA在细胞中 呈红色荧光分布，并且伴随着管状核酸自组装纳米制剂的增加，DNA纳米管进入细胞的量增 加。流式细胞仪检测结果（见图5C)显示：核酸纳米制剂较单独的Cy3-mTOR siRNA转染细 胞具有更高的平均荧光密度，差异显著。
[0066] 实施例4 :管状核酸纳米制剂对细胞mTOR mRNA、蛋白表达的影响
[0067] 转染前一天，计数PASMC细胞，细胞爬片，接种于细胞培养瓶中，以50pmol/ml管状 核酸纳米制剂转染PASMC细胞，将自组装核酸纳米管纳米材料转染PASMC细胞进行比较。 转染后分别在〇小时、12小时、24小时和48小时后，应用PBS冲洗2遍；加入TRIzol试剂 (美国Invitrogen公司）lml，按照TRIzol试剂提取说明书进行RNA提取。应用核酸定量 分析仪测定RNA浓度和纯度。所有RNA的A260/A280比值均在1. 8?2. 0之间。然后用逆 转录PCR(RT-PCR)试剂检测各时间点mTOR mRNA的情况，β-actin作为阳性对照。引物设 计如下：
[0068] mT0R(195bp)，
[0069] F ：5' CGCAGGGAAGGTGATGAGGAAT 3'，（SEQ ID NO :6)
[0070] R ：5' GCTAAGGAGCAGCCAGGGAGAT 3r ；(SEQ ID NO ：7)
[0071 ] β -actin(432bp)，
[0072] F ：5' TCAGGTCATCACTATCGGCAAT3，（SEQ ID NO :8)
[0073] R :5，AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA3' （SEQ ID NO :9)。
[0074] RT反应条件：45°C、45分钟，95°C、30秒，4°C、10分钟，反应体积为10μ1 ;PCR反应 条件为：94°C、3分钟变性，循环条件为94°C、30秒，54°C、45秒，72°C、30秒，35次循环，72°C 延伸10分钟，反应体积为50 μ 1。应用自动成像分析仪对PCR产物进行半定量分析。
[0075] 转染前一天，计数PASMC细胞，细胞爬片，接种于6孔板中，以50nM mTOR siRNA， 转染PASMC细胞进行比较。转染48小时后，从培养箱中取出细胞，弃掉细胞培养液，应用 预冷的PBS冲洗2遍。每瓶加入细胞裂解液200 μ 1蛋白裂解液提取细胞总蛋白，并测定 蛋白浓度。取40 μ g蛋白经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳2小时分离蛋白[聚丙烯酰胺凝胶 配方如下（15ml):去离子水，6.9ml ;30%双丙烯酰胺（丙烯酰胺29g加上Ν，Ν' -亚甲双 丙烯酰胺lg，溶解于100m去离子水），4ml ;Tris缓冲盐溶液（在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0. 2g KCl 和 3g Tris 碱，pH 值调至 7. 4,用蒸馏水定容至 1L)，4. 8ml ;10% SDS :(称 取IOOg SDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水 定容至1L)，0. 15ml ;10%过硫酸镁（IOg过硫酸镁溶于IOOrnl去离子水中），0. 15ml ; β -疏 基