⑶86, Anti-MHC-II流式抗体说明书加入流 式抗体，经流式细胞仪检测。
[0056] 抑制率（％) = (Con A组A均值-样品组A均值）ACon A组A均值-细胞对照 组A均值）X 100 %
[0057] 存活率（％)=样品组A均值/细胞对照组A均值）X 100%
[0058] SPSS19. 0 计算 IC50值。
[0059] 3实验结果
[0060] 首次发现2H-1-苯并吡喃-2-酮能明显抑制Con A诱导的T细胞增殖及LPS诱导 的B细胞增殖，其IC5。值分别是3. 500 μ g/ml，11. 272 μ g/ml。抑制T细胞增殖的阳性药CsA 的IC5。值是0· 063 μ g/ml，抑制B细胞增殖的阳性药MMF的IC 5。值是1. 653 μ g/ml。同时， 通过三种药物对细胞存活率的影响发现2H-1-苯并吡喃-2-酮对细胞的毒性与两种阳性药 相比均较小，具体结果见表1，图3。同时，2H-1-苯并吡喃-2-酮可呈剂量依赖性的诱发T、 B细胞的凋亡，较高剂量的2H-1-苯并吡喃-2-酮能降低B淋巴细胞表面CD268,及DC表面 ⑶86的表达。具体结果见图4,图5,图6。
[0061] 表1各药物抑制T、B细胞的IC5。值的比较表
[0062]
[0063] 表1为环孢素（CsA)、霉酚酸酯（MMF)、2H-1-苯并吡喃-2-酮（ADMC)对T、B淋巴 细胞抑制作用的IC 5。值的比较，2H-1-苯并吡喃-2-酮表现出较好的T、B淋巴细胞抑制作 用。
[0064] 实施例3
[0065] 2H-1-苯并吡喃-2-酮对LPS诱导RAW264. 7细胞分泌NO及TNF- α的影响
[0066] 1 材料
[0067] I. 1细胞系
[0068] 小鼠单核巨噬细胞RAW264. 7细胞系，购自华中科技大学同济医学院细胞实验平 台。
[0069] 1. 2 试剂
[0070] 脂多糖（LPS)，购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基，购自美国HyClone公司， 胎牛血清（FBS)，双抗，购自美国Gibco公司；一氧化氮检测试剂盒，购自中国碧云天生物 技术研究院；小鼠 TNF-α定量分析酶联免疫检测试剂盒，购自上海巧伊生物科技有限公 司。TLR4蛋白抗体，购自美国Santa Cruz公司；DMSO(二甲基亚砜），购自北京鼎国昌盛生 物技术有限公司；2H-1-苯并吡喃-2-酮样品由本实验室合成，地塞米松（DXMS)，购自美国 Sigma公司，均用DMSO配制。
[0071] 1.3 仪器
[0072] 酶联免疫检测仪（MK型，Thermo公司，芬兰），CO2培养箱（HF90型，力康发展有限 公司），超净工作台（sw-cJ-2FD双人型，苏州安泰空气技术有限公司）等。
[0073] 2 方法
[0074] 取对数期生长的RAW264. 7细胞，用细胞刮刮下贴壁细胞，吹打混匀制成细胞悬 液，按照每孔2X IO5个细胞数铺至24孔板，每孔0. 5ml。分组：细胞对照组（含等浓度的 DMS0)，LPS刺激组，2H-1-苯并吡喃-2-酮样品组及地塞米松样品组（浓度统一定为2. 5， 5,10, 20,40,80 μ g · mL-1)，各设3个复孔，重复3次。培养24h (37°C，5% CO2，饱和湿度） 后，以LPS诱导巨噬细胞毒性，并与药物同时作用24h。根据一氧化氮检测试剂盒说明书测 定样品组NO抑制率及含量，根据TNF-α检测试剂盒说明书测定样品中TNF-α的含量。
[0075] 将2Η-1-苯并吡喃-2-酮作用浓度为0, 2. 5, 5,10 μ g ^mL-I组及LPS刺激组提取 细胞总蛋白，用于Western Blot检测TLR4蛋白的表达水平。
[0076] NO抑制率（％) = (LPS刺激组A均值-样品组A均值）ALPS刺激组A均值-细 胞对照组A均值）X 100 %
[0077] 3实验结果
[0078] 首次发现2H-1-苯并吡喃-2-酮可明显抑制LPS诱导的巨噬细胞NO及TNF- α的 分泌，其中抑制NO分泌的IC5。值为31. 47 μ g/ml，并且呈浓度依赖性的抑制TLR4蛋白的表 达水平。具体结果见表2,图7,图8。
[0079] 表2.地塞米松（DXMS)、2H-1-苯并吡喃-2-酮（ADMC)抑制NO分泌的IC5。值比较 表
[0080]
[0081] 实施例4
[0082] 2H-1-苯并吡喃-2-酮对BXPC-3, !fepG2, Hela细胞增殖的影响
[0083] 1 材料
[0084] I. 1细胞系
[0085] 人胰腺癌细胞系BXPC-3,人肝癌细胞系H印G2,人宫颈癌细胞系Hela，人正常胰腺 导管上皮细胞系HPDE6C7,购自华中科技大学同济医学院细胞实验平台。
[0086] 1. 2 试剂
[0087] 噻唑蓝（MTT)购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基，购自美国HyClone公司，胎 牛血清（FBS)，双抗，0.25%胰酶，购自美国Gibco公司；DMSO(二甲基亚砜），购自北京鼎国 昌盛生物技术有限公司；2H-1-苯并吡喃-2-酮样品由本实验室合成，5-氟尿嘧啶（5-FU)， 购自美国Sigma公司，用DMSO配制。
[0088] 1. 3 仪器
[0089] 酶联免疫检测仪（MK型，Thermo公司，芬兰），CO2培养箱（HF90型，力康发展有限 公司），超净工作台（SW-CJ-2FD双人型，苏州安泰空气技术有限公司）等。
[0090] 2 方法
[0091] 取对数生长期的BXPC-3, !fepG2, Hela细胞，胰酶消化细胞，吹打混匀，按每孔5000 个细胞数铺至96孔板，每孔200 μ 1。分组：细胞对照组（等浓度DMSO)，2H-1-苯并吡 喃-2-酮样品组，5-FU样品组（浓度统一定为2. 5, 5,10, 20,40,80 μ g ·ιΛ-1)，培养基空白 组。培养2处(37°(：，5%0)2，饱和湿度）后吸去培养基，加入含不同浓度样品的培养基，继 续培养 20h 后，加入 MTT 20 yL(0. 5mg · mL-1)，培养 4h，离心 6min(1500r · min-1)，弃上清 后各孔均加 DMSO 150 μ L轻微振荡lOmin，酶标仪492nm测吸光度值（A值）。
[0092] 同样方法检测2H-1-苯并吡喃-2-酮对HPDE6C7细胞系的细胞毒性作用。
[0093] 抑制率（％ )=(细胞对照组A均值-样品组A均值）八细胞对照组厶均值-培 养基空白组A均值）X 100%
[0094] 3实验结果
[0095] 首次发现2H-1-苯并吡喃-2-酮能明显抑制BXPC-3, !fepG2, Hela细胞的增殖，且 对人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6C7毒性较小。因此，2H-1-苯并吡喃-2-酮（ADMC)具 有一定的抗胰腺癌、肝癌、宫颈癌的活性。具体结果见图9。
【主权项】
1.具有以下结构式的2H-1-苯并吡喃-2-酮在制备免疫抑制剂中的应用，7.具有以下结构式的2H-1-苯并吡喃-2-酮在制备抑制炎性因子NO、TNF-a分泌的 药物中的应用，8. 具有以下结构式的2H-1-苯并吡喃-2-酮在制备用于治疗癌症的药物中的应用，9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的癌症为胰腺癌、肝癌或宫颈癌。
【专利摘要】本发明涉及医药学领域，通过对2H-1-苯并吡喃-2-酮的实验研究，首次发现2H-1-苯并吡喃-2-酮可明显对抗刀豆蛋白A(ConA)诱导的T淋巴细胞增殖、脂多糖(LPS)诱导的B淋巴细胞增殖及巨噬细胞毒性，可降低LPS诱导的B淋巴细胞表面B细胞活化因子受体(BAFF-R)CD268的表达及髓来源DC细胞和LPS诱导的原代DC细胞表面共刺激分子CD86的表达，具有免疫抑制作用及抗炎作用。同时对多种癌细胞系的增殖具有明显抑制作用，可用于制备免疫抑制剂及抗炎、抗癌药物。
【IPC分类】A61K31/37, A61P29/00, A61P37/06, A61P35/00
【公开号】CN105012295
【申请号】CN201510414085
【发明人】向明, 杜姣, 刘秀兰
【申请人】华中科技大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月15日