。
[0023] 图9Pen-d/n-ATF5-RP促使MRI和组织学检查显示的小鼠神经胶质瘤的快速及持 续退化/根除。（A)用Pen-d/n-ATF5-RP治疗前以及治疗（如文中所述）后不同时间的小 鼠脑部的增强后3DFLASHMRI扫描。治疗前图像显示的是注射roGF-B-HA/shp53逆转录 病毒后243天的脑皮层。黄色箭头指出了双侧肿瘤的位置。小鼠脑皮层同一位置的治疗后 图像是进行第二次Pen-d/n-ATF5-RP给药后的所示不同时间时的图像。治疗后图像中的黄 色箭头指明了原肿瘤的位置。（B)第二次Pen-d/n-ATF5-RP治疗后192天获得的同一小鼠 脑部的H&E图像。区域1代表（A)中最后时间点时所示的切片的位置，治疗前，肿瘤出现在 这个区域中。请注意，未出现表征神经胶质瘤的细胞核浓染和较高细胞密度。（C)区域2中 的Ki67着色（来自图像A/治疗后176天）。请注意，神经胶质瘤中未见Ki67+/增殖细胞。 (D)来自区域1的切片的HA/DAPI着色。清注意，未见表达外源性TOGF-B-HA的细胞。（E) 切片区域1的GFAP/DAPI着色。请注意，GFAP+细胞簇与先前肿瘤出现处的胶质瘢痕的出 现相一致。附近切片无HA着色证实了肿瘤细胞的消失。绿色对角线条带是由于组织褶皱 造成的。比例尺为20ym。
[0024] 图10具有双侧肿瘤的未经治疗的小鼠的MRI图像和组织病理学图像。中间图像 显示了注射roGF-B-HA/shp53逆转录病毒后112天的荷瘤小鼠脑部的增强后3DFLASHMRI 图像。图像（A)和图像⑶显示了用HA染色指示肿瘤细胞的切片以及用DAPI指示细胞核 的切片。MRI图像上带有字母的黄色箭头指示的是（A)和（B)中所示的HA+切片的相关位 置。逆转录病毒注射在B侧。比例尺为20ym。DAPI(40,6-二脒基-2-苯基吲哚）。
[0025] 图11解释说明Pen-d/n-ATF5-RP促使MRI和组织学检查显示的小鼠神经胶质瘤 快速而持续退化/根除的第二个实例。（A)用Pen-d/n-ATF5-RP治疗前以及治疗（如文中 所述）后不同时间的荷瘤小鼠脑部的增强后3DFLASHMRI图像。治疗前冠状面及横断面 图像（注射roGF-B-HA/shp53逆转录病毒后74天）显示了脑皮层内的多病灶肿瘤（箭头 所指）。显示了进行如本文所述的两次Pen-d/n-ATF5-RP皮下治疗后8天、21天和181天 时同一小鼠脑部的图像。请注意，治疗后8天，信号减弱，治疗后21天和181天，信号消失。 (A'，A'）对肿瘤体积的估算证实进行Pen-d/n-ATF5-RP治疗后8天信号衰减。与（A)中图 像相同的带箭头（指示肿瘤病灶（黄色圆圈））的治疗前图像和治疗后8天的图像中，用感 兴趣区域椭圆柱工具（黄色圆圈）对肿瘤病灶进行体积测定。在治疗前，（A'）中计算出的 病灶1、病灶2和病灶3的体积分别为0. 597立方晕米、0. 16位方晕米和0. 760立方晕米。 对于治疗后8天的肿瘤（A")，病灶1、病灶2和病灶3同一肿瘤的体积分别减小至0. 106立 方毫米、0.0303立方毫米和0.0895立方毫米。治疗后21天，无法直观测量到肿瘤。（B)同 一个被杀死的小鼠脑部H&E着色（治疗后183天；初次肿瘤检测后190天）证实没有可检 测到的肿瘤，箭头指示为与A'中所示的肿瘤病灶1对应的残余瘢痕，并且证实无可检测到 的肿瘤。（C)同一脑部的HA免疫染色（用于检验TOGF-B-HA)显示出与（A'）和（B)所示 相同的病灶1区域内未见可检测到的肿瘤细胞。（D)同一脑部病灶1的GFAP免疫染色显示 了残余GFAP+神经胶质瘢痕。（E)同一脑部病灶1区域的Ki67免疫染色显示未见分裂细 胞。B-E的比例尺为20ym。
[0026] 图12用Pen-d/n-ATF5-RP治疗的患神经胶质瘤小鼠的长期存活及肿瘤生长的结 果。（A)经过Pen-d/n-ATF5-RP治疗的（如本文所述皮下给药）或未经治疗的患神经胶质 瘤小鼠（通过MRI确定）的存活。在九个对照小鼠中，有四个对照小鼠用Pen-对照-RP肽 进行治疗，五个未经治疗。实验终点是初次MRI检测肿瘤后200天。通过时序检验获得的 存活分析显不P_值=〇? 〇〇〇7(http://in_silico.net/tools/statisties/survivor) 〇 (B) 用Pen-d/n-ATF5-RP进行如本文所述的皮下治疗之前和之后的荷瘤小鼠的MRI结果。后者 的时间范围是肿瘤治疗后176-225天（肿瘤检测后183-230天）。（C)经Pen-d/n-ATF5-RP 治疗的小鼠和对照小鼠的脑部肿瘤组织病理学检查结果。在所有情况下，MRI都证实了治疗 前肿瘤的存在。对照小鼠如（A)中所描述，脑部的获取是在死亡之后（6只对照动物）、或者 在6个月的实验终点（4只经过治疗的动物）之后、或者在出现与肿瘤无关的健康问题后被 杀死之后（2只未经治疗的动物）。对于经过治疗的动物，在肿瘤发生后260-438天（Pen-d/ n-ATF5-RP给药后183-259天，初次肿瘤检测后190-305天）进行组织学分析。脑部切片 如方法部分所述进行制备，用H&E染色，并且进行Ki67和HA免疫染色（以识别roGF-B-HA+ 肿瘤细胞）。肿瘤的出现/消失是基于观察细胞核浓染、高细胞密度、Ki67染色和HA免疫 染色增多而定。
[0027] 图13显示了TAT-d/n-ATF5 (TAT-ZIP)促使培养的黑色素瘤MEL501细胞的凋亡性 死亡。连接有TAT的显性阴性ATF5肽以所示浓度（单位yM)加入MEL501黑色素瘤细胞的 培养基。四天以后，用Hoescht染料对细胞染色，细胞染色是为了显示凋亡细胞核的比例。
[0028] 图14显示，TAT-d/n-ATF5 (TAT-ZIP)降低了内源性ATF5在培养的U373成胶质细 胞瘤细胞中的表达。将连接有TAT的显性阴性ATF5肽以所示浓度（单位yM)加入到U373 成胶质细胞瘤细胞的培养基中17小时天，然后收获细胞，用Western免疫印迹对收获的细 胞的内源性ATF5水平进行分析。请注意，TAT-d/n-ATF5大大降低了内源性ATF5的表达。 之前的研究已经表明肿瘤细胞需要内源性ATF5才能存活，细胞穿透TAT-ZIP肽杀死肿瘤细 胞的作用机制可能是由于导致内源性ATF5蛋白缺失而致。还请注意当TAT-ZIP肽存在时 的内源性ATF5上面的涂片。这说明TAT-ZIP通过引起内源性ATF5泛素化和蛋白酶降解而 使内源性ATF5减少。
[0029] 图15显示，TAT-d/n-ATF5 (TAT-ZIP)肽诱导促凋亡基因DDIT3 (CHOP)在不同肿瘤 细胞系中的表达。用TAT-d/n-ATF5以所示时间和剂量（单位yM)对细胞进行处理，然后收 获细胞，并用Western免疫印迹对收获的细胞的CHOP和其他无响应蛋白的表达进行分析。 请注意，CHOP在所有情况下都升高。由于CHOP可促使细胞死亡，这些数据表明CHOP蛋白 的诱导可能是TAT-d/n-ATF5杀死肿瘤细胞的机制之一。
[0030] 图16显示，siRNA使CHOP蛋白沉默（顶部的Western免疫印迹）部分地保护U87 细胞免于由TAT-d/n-ATF5肽导致的死亡。使用siCH0P(顶部的Western免疫印迹）或对 照siRNA对细胞进行处理，使CHOP表达沉默。然后将其暴露于TAT-d/n-ATF5两天，对细胞 中凋亡细胞核比例进行测定。数据支持了TAT-d/n-ATF5杀死肿瘤细胞的机制部分在于提 高了肿瘤细胞CHOP的表达进而间接促成了细胞死亡这一观点。
[0031] 图17显示，TAT-D/N-ATF5下调BCL2生存蛋白水平。用所示浓度的TATZIP(TAT-d/ n-ATF5肽）（单位yM)对培养的U87人成胶质细胞瘤细胞处理30小时。然后收获细胞，用 Western免疫印迹对收获的细胞的存活蛋白BCL2的表达进行测定。这些结果表明，除了提 高促凋亡CHOP外，TAT-d/n-ATF5杀死肿瘤细胞的机制还在于降低了肿瘤细胞BCL2存活蛋 白的水平。
[0032] 图18显示，TAT-D/N-ATF5与替莫唑胺（TMZ)协同杀死培养的U87成胶质细胞瘤 细胞。用亚致死水平的了41'-(1/1141?5〇'21?11^)和11^(5〇1^)分别或共同与细胞培养 一天，然后对具有凋亡细胞核的细胞比例进行测定。TMZ目前是人GBM的一线治疗药物。数 据显示TAT-d/n-ATF5不仅在TMZ存在的情况下发挥作用，而且两种药物协同配合杀死GBM 细胞。这说明TAT-d/n-ATF5可以给予正在服用TMZ的病人。
[0033] 图19描绘了正如MTA检验测得的，用重组TAT-d/n-ATF5 (3yM)处理3-5天降低 了两种人GMB细胞系和一种小鼠GMB细胞系的生存能力。
[0034] 图20描绘了如MTA检验所测量得的，用合成PEN-d/n-ATF5处理降低了培养的U87 成胶质细胞瘤细胞的生存能力。用所示浓度（yM)处理5天。
[0035] 图21描绘了正如AnnexinV/PI着色和流式细胞计显示的，用重组TAT-d/n-ATF5 处理促进了培养的U87人成胶质细胞瘤细胞死亡。左下象限中（88%对照对比58%治疗过 的）显示了活细胞比例。死亡细胞比例在右下象限和右上象限中显示（9%对照对比36% 治疗过的）。
[0036] 图22描绘了合成PEN-d/n-ATF5促使生长在类似半球的培养基中的原发性GS9-6 人成胶质细胞瘤干细胞的凋亡性死亡。处理6天的结果以及用AnnexinV/PI着色和流式 细胞计确定的数据。
[0037] 图23描绘了重组PEN-d/n-ATF5促使生长在类似半球的培养基内的原发性GS9-6 人成胶质细胞瘤干细胞的凋亡性死亡。处理5天以及用AnnexinV/PI着色和流式细胞计 确定的数据。 4.【具体实施方式】
[0038] 4. 1ATF5&D/N-ATF5 组合物
[0039]ATF5被各种不同类型的肿瘤广泛表达。特别地，ATF5不仅在高度增殖的神经肿瘤 内表达（例如成胶质细胞瘤），而且还在多个部位的肿瘤形成内表达，其中包括但不必需局 限于：乳腺、子宫、子宫内膜、胃、结肠、肝、胰腺、肾脏、膀胱、前列腺、睾丸、皮肤、食道、舌头、 嘴、腮腺、喉、嗯、淋巴结、肺、血液系统癌症、周围神经系统和脑肿瘤。
[0040] 在本文中，"ATF5"包括"ATF5蛋白"和"ATF5类似物"。除非另有说明，"蛋白"应 包括蛋白质、蛋白质结构域、多肽、或者肽、及它们的任意片段。ATF5蛋白质具有NCBI注册 号NP_001180575 (人ATF5)或NCBI注册号NP_109618 (鼠ATF5)的氨基酸序列，包括其保 守替换物。在本文中，"保守替换物"是那些与替换的氨基酸残基在功能上等同的氨基酸 替换物，这是因为它们具有相似的极性或空间排列，或者是因为它们属于与取代残基相同 的类别（例如，狂犬病的、酸性的、或者碱性的）。如下所述，Western免疫印迹已经印证了 ATF5蛋白质的主要细胞形式。ATF5cDNA序列预测了两个潜在的框内蛋氨酸起始位点，所述 起始位点将导向大约为30kDa和20kDa的蛋白质。人们观察到细胞内ATF5的主要形式具 有20-22kDa的表观分子量，这说明第二位点被优先利用。当第一蛋氨酸的上游含有标准 Kozak起始共有序列时，较大蛋白质被表达，因此这说明22-kDa形式不是由30-kDa前体的 细胞分裂形成。因此，本发明的ATF5蛋白质还包括其22-kDa和30-kDa异构体。
[0041] 本文所使用的"ATF5类似物"是ATF5蛋白的功能性变体，具有ATF5生物活性，与 ATF5蛋白有62%或更高（在某些实施例中为70%或更高，或者80%或更高，或者90%或更 高，或者95%或更高）的氨基酸序列同源性。在本文中还使用的"ATF5生物活性"是指在 本文所述检测条件下ATF5蛋白或ATF5类似物与CRE物理联系或结合的活性（即，不受负 控制影响的大约两重结合或者更优选的五重结合），但亲和性可与天然ATF5有所不同。
[0042] 专业人员明白ATF5中的氨基酸编号可与本文所述的氨基酸编号不同，或者可包 含某些传统氨基酸取代物，这些传统氨基酸取代物产生与本文所述相同的、与活性相关的 ATF5-CRE。其他异构型的对应氨基酸和传统取代物或者类似物可通过目视检查相关氨基酸 序列或者使用商用同源性软件程序轻易地分辨出来。
[0043] 如实例部分所述，在试管内和体内对ATF5的功能和/或活性的干扰促进了多形性 成胶质细胞瘤（GBM)的细胞凋亡。而且，已经证明有选择地对其他癌症类型的ATF5功能和 /或活性进行干扰可引发细胞死亡。培养及动物研究也表明GBM细胞需要转录因子ATF5存 在才能存活，在具有内源性神经胶质瘤的老鼠模型中用CP-d/n-ATF5进行有限的皮下治疗 明显根除了肿瘤，而且无明显毒副作用。如所附实例中强调的，通过施用CP-d/n-ATF5进行 这种ATF5干扰的确效果显著，这是因为对ATF5功能和/或活性的干扰促进了赘生性细胞 死亡，但不损害正常细胞。
[0044] 本文所使用的"显性阴性ATF5"或"d/n-ATF5"为一种包含部分人ATF5氨基酸序 列的肽。在某些实施例中，d/n-ATF5肽包含序列LEQENAELEGECQGLEARNRELKERAES，其中， 加下划线序列为显性阴性序列，其余序列为ATF5亮氨酸拉链。在某些实施例中，d/n-ATF5 由包含序列CTGGAACAGGAAAACGCGGAACTGGAAGGCGAATGCCAGGGCCTGGAAGCGCGCAACCGCGAACT GAAAGAACGCGCGGAAAGCTAA的核酸编码。在某些实施例中，d/n-ATF5肽包含LEKEAEELEQE NAELEGECQGLEARNRELKERAES〇 在某些实施例中，d/n_ATF5 由包含序列CTGGAAAAAGAAGCGG AAGAACTGGAACAGGAAAACGCGGAACTGGAAGGCGAATGCCAGGGCCTGGAAGCGCGCAACCGCGAACTGAAAGA ACGCGCGGAAAGCTAA的核酸编码。在某些实施例中，d/n-ATF5肽包含序列LARENEELLEKEA EELEQENAELEGECQGLEARNRELKERAES，其中，加下划线序列为显性阴性序列，其余序列为ATF5 亮氨酸拉链。在某些实施例中，d/n-ATF5由包含序列CTGGCGCGCGAAAACGAAGAACTGCTGGAA AAAGAAGCGGAAGAACTGGAACAGGAAAACGCGGAACTGGAAGGCGAATGCCAGGGCCTGGAAGCGCGCAACCGCGA ACTGAAAGAACGCGCGGAAAGCTAA的核酸编码。在某些实施例中，d/n_ATF5肽包含序列LEQRA EELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELKERAES，其中，加下划线序列为显性阴性序 列，其余序列为ATF5亮氨酸拉链。在某些实施例中，d/n-ATF5由包含序列CTGGAACAGCGC GCGGAAGAACTGGCGCGCGAAAACGAAGAACTGCTGGAAAAAGAAGCGGAAGAACTGGAACAGGAAAACGCGGAAC TGGAAGGCGAATGCCAGGGCCTGGAAGCGCGCAACCGCGAACTGAAAGAACGCGCGGAAAGCTAA的核酸编码。 在某些实施例中，d/n-ATF5 肽包含序列LEQRAEELARENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNR ELKERAESV，其中，加下划线序列为显性阴性序列，其余序列为ATF5亮氨酸拉链。在某些 实施例中，d/n-ATF5 由包含序列CTGGAACAGCGCGCGGAAGAACTGGCGCGCGAAAACGAAGAACTGCTGG AAAAAGAAGCGGAAGAACTGGAACAGGAAAACGCGGAACTGGAAGGCGAATGCCAGGGCCTGGAAGCGCGCAACCGC GAACTGAAAGAACGCGCGGAAAGCGTGTAA的核酸编码。在某些实施例中，包含ATF5亮氨酸序列 LEGECQGLEARNRELKERAESV的d/n-ATF5 还将包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23或者24个额外(：端41?5亮氨酸拉链残基。在某些实施例中， d/n-ATF5肽由前述肽序列之一构成。
[0045]本文所使用的"显性阴性ATF5 "或"d/n-ATF5 "是一种包含部分大鼠或小鼠ATF5氨 基酸序列的肽。在某些实施例中，d/n-ATF5肽包含序列LEQENAELEGECQGLEARNRELRERAES, 其中，加下划线序列为显性阴性序列，其余序列为ATF5亮氨酸拉链。在某些实施例中，d/ n-ATF5 由包含序列CTGGAACAGGAAAACGCGGAACTGGAAGGCGAATGCCAGGGCCTGGAAGCGCGCAACCG CGAACTGCGCGAACGCGCGGAAAGCTAA的核酸编码。在某些实施例中，d/n-ATF5肽包含序列LE KEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELRERAES，CTGGAAAAAGAAGCG其中，加下划线序列为显性阴性 序列，其余序列为ATF5亮氨酸拉链。在某些实施例中，d/n-ATF5由包含序列GAAGAACTGG AACAGGAAAACGCGGAACTGGAAGGCGAATGCCAGGGCCTGGAAGCGCGCAACCGCGAACTGCGCGAACGCGCGGA AAGCTAA的核酸编码。在某些实施例中，d/n-ATF5肽包含序列LARENEELLEKEAEELEQENAE LEGECQGLEARNRELRERAES，其中，加下划线序列为显性阴性序列，其余序列为ATF5亮氨酸 拉链。在某些实施例中，d/n-ATF5 由包含序列CTGGCGCGCGAAAACGAAGAACTGCTGGAAAAAGAA GCGGAAGAACTGGAACAGGAAAACGCGGAACTGGAAGGCGAATGCCAGGGCCTGGAAGCGCGCAACCGCGAACTGC GCGAACGCGCGGAAAGCTAA的核酸编码。在某些实施例中，d/n-ATF5肽包含序列LEQRAEELA RENEELLEKEAEELEQENAELEGECQGLEARNRELRERAES，其中，加下划线序列为显性阴性序列，其 余序列为ATF5亮氨酸拉链。在某