乳化剂、赋形剂、增量剂、助流剂、增溶剂、稳定剂、悬浮剂、张度剂、运载剂和增黏剂。 如有必要，也可添加药物添加剂，例如抗氧化剂、留香剂、着色剂、增味剂、防腐剂和甜味剂。 药学上可接受的载体实例包括羧甲基纤维素、结晶纤维素、甘油、阿拉伯树胶、乳糖、硬脂酸 镁、甲基纤维素、粉末、生理盐水、海藻酸钠、蔗糖、淀粉、滑石和水，等等。
[0086] 本发明的CP-d/n_ATF5制剂可用制药领域中众所周知的方法制备。例如，CP-d/ n-ATF5可作为悬液或溶液与载体或稀释剂联合。可选择地，可添加一种或多种助剂（例如， 缓冲剂、调味剂、表面活性剂、等等）。载体的选择取决于给药途径。如本文所述，药物组合 物将有助于将CP-d/n-ATF5施用给治疗对象以治疗肿瘤和/或赘生性细胞。对治疗对象施 用所述药物组合物，CP-d/n-ATF5以有效治疗该治疗对象体内的肿瘤和/或赘生性细胞的 剂量给予。如上所述，该使用剂量可由本领域技术人员很容易地确定。
[0087] 本发明的组合物还可包括其他治疗剂。例如，治疗剂可包括任意一种或多种抗癌 剂。在某些实施例中，所述一种或多种抗癌剂将选自由以下各项组成的集群：烷化剂、抗代 谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗生素以及抗体/抗体药物偶联物。在某些实施例中， 这些抗癌剂在本发明组合物中的剂量与这些抗癌剂以相似方式给药的正常剂量相比较小。 [0088] 本发明还提供了在治疗和/或预防肿瘤和/或赘生性细胞中使用的试剂盒。在某 些实施例中，试剂盒包括CP-d/n-ATF5分子和药学上可接受的载体。在某些实施例中，试剂 盒还包括给药装置，例如但不局限于，预装药注射器、笔、栗或其他用于CP-d/n-ATF5肠胃 外给药的预装填装置。在某些实施例中，试剂盒将包括配制用于鼻内给药的CP-d/n-ATF5， 例如但不局限于，定量雾化吸入器或其他市售的可用于或适于如上所述组合物鼻腔给药的 给药装置。
[0089] 通过以下实例对本发明进行描述，实例仅用于帮助理解本发明，并不以任何方式 作为对所附权利所界定的本发明范围的限制。
[0090] 5?实例
[0091] 5.lCP-d/n-ATF5 实例
[0092] 5. 1. 1材料和方法
[0093]d/nATF-5 的截短。将pQCeGFP-d/n-ATF5 质粒（参见，Angelastro等，JNeurosci 2003 ;23(11) :4590-600)作为模板，使用上游引物5'-TCCGCGGCCGCACCGGTCGCC-3' 和下游引物 5'-CTCGAGGATATCTCAGITATCTACACTGACTCTGCCCTCTCCCTC AG-3'的PCR从3'质粒截去75个碱基对。经电泳纯化的eGFP-d/nATF5-tr(tr=截短的） cDNA被连接到pGEM-TEasy克隆载体（普洛麦格公司）内，转化成DH5a细胞，然后放在具 有蓝白筛的LB琼脂-氨苄西林平皿上。筛选出来的菌落与氨苄西林在LB中经过整夜扩增。 与培养液（小量制备，Invitrogen)隔离的质粒用琼脂和EcoRV消解，随后进行琼脂糖凝胶 电泳来检验d/n-ATF5-tr的插入，然后对插入物进行DNA测序来进行验证。被Agel/EcoRV 消解的eGFP-d/n-ATF5-trcDNA被连接到经Agel/EcoRV消解纯化的pQCXIX(Clontech)表 达载体内。连接后的混合物被用于转化DH5a细菌，得到的产物通过Agel/EcoRV消解、小量 制备的细菌培养液的凝胶电泳以及未切质粒的DNA测序进行验证。pQC-eGFP-d/n-ATF5-tr 质粒在Maxiprep(Invitrogen)中生长。
[0094]CP-6xHis-Pen-Flag-tagged-d/n_ATF5 蛋白质生产和生物测定。为了制出〇611_ Penetrating-6xHis-Penetratin-Flag-tagged-d/n-ATF5_tr(CP-6xHis-Pen_Flag-tagged -d/n-ATF5-tr)cDNA，首先使用PCR，所述PCR使用上游引物 5'-TTAAITAAGCCGCCATGG ATGCGTCAAATTAAAATTTGGTTTCAAAATCGTCGTATGAAATGGAAAAAAATGGACTAC AAGGACGATGAT-3' 和下游引物 5'-CTCGAGGGATCCTCAGITATCTACACTGACTCT GCCCTCTCCCTCAG-3'，并将pQC-Flag-d/n-ATF5-tr作为模板。所得产物经过凝胶电泳 后被纯化，然后连接到pGEM-TEasy克隆载体内。产物被转化成DH5a细胞然后用于白色 菌落筛选。Miniprep克隆物用EcoRV消解，随后进行凝胶电泳和未切质粒测序以对插入物 进行验证。为了在N-端处插入6xHis标签，将Pen-d/n-ATF5-RP_tr克隆到pET_15b表达 载体（Novagen)中。pET_15b和pGEMT-Pen-d/n-ATF5-RP_tr载体用Nde-1 和BamHl进行消 解，切割过的pET-15b通过凝胶电泳与插入物分离。同样的，切割过的pET-15b通过凝胶电 泳与插入物分离。pET-15b和Pen-d/n-ATF5-RP-tr被从凝胶中切离并纯化，然后用T4DNA 连接酶进行连接。连接后的材料用于转化DH5a细胞和筛选出的菌落。小量制备的构造物 用Xba-1和EcoRV消解，以便利用凝胶电泳来验证载体和Pen-d/n-ATF5-RP插入物的存在。 通过DNA测序来验证pET-15b-Pen-d/n-ATF5-RP正确的方位和序列。
[0095] 为了生成CP-6xHis-Pen-Flag-tagged-d/n_ATF5蛋白质，将表达构造物转化成 BL21DE3pLysS细胞（Novagen)。筛选出菌落，并在LB中将菌落扩增。用ImMIPTG诱导肽产 品，并用SDS-PAGE对肽产品进行验证。一旦诱导得到验证，就用基于去污剂的BugBuster mastermix系统（Novagen)进行抽提。使用Pen-Flag-tagged-d/n_ATF5 肽的N-端 6xHIS_标签和钴吸附柱系统（HisPur;ThermoFisher)完成Pen-Flag-tagged-d/n_ATF5肽 隔离与纯化。纯化后的肽被除去盐分，然后使用Zeba除盐离心柱（ThermoFisher)或G-25 葡聚糖凝胶（GEHealthCare)与PBS进行缓冲液置换。除盐后的蛋白质用0.20ym聚醚 砜膜注射器式过滤器（Sarstedt)进行无菌过滤。最后，用AmiconUltra-4离心过滤器装 置（3000MWCutoff)将肽浓缩至l-2mg/ml。
[0096] 使用相同的方法通过利用PCR上游引物5'-CCCGGGCATATGCGTCAAATTAAAATITGG ITT-3' 和下游引物 5' -CTCGAGGGATCCTCAGTTATCTAGTCTGGGTCTCTTCC-3' 消除构造物的d/ n_ATF5部分来创建和生成对照肽（Pen-Flag-tagged-Control)。
[0097] 质谱分析。标称分子量测量的线件MALDI-T0F分析:用装备有MALDI-T0F/T0F激 光源（355nm)的质谱仪（4700ProteomicsAnalyzer，ABSciex)进行基质辅助激光解吸/ 电离（MALDI)测量。将样本以斑点状分布于具有等体积MALDI基质的平皿上并风干。仪器 在20kV加速电压下运行。光谱获得自平均4000次激光发射的信号。质谱分析在质量范围 10, 000-60, 000m/z的阳离子线性模型中进行。通过DataExplorer4. 5(ABSciex)对数据 进行进一步分析。
[0098]LC-MS分析:将样本沣射到AerisWid印oreXB-C8 柱（3. 6y，2. 10X50mm)上。 以250y1/min的流速冲刷标准反相斜面8分钟，由LTQ-〇rbitrapXL质谱仪在轮廓模式 (ThermoFisher)下对洗提液进行监控。使用IonMaxSource(ThermoFisher)作为电喷 雾离子源，离子源参数为喷雾电压5kV、毛细管温度275°C以及鞘气设置20。在分辩率设置 为15, 000FWHM时用质量锁定特征获取光谱数据。
[0099]pQC-eGFP-d/nATF-5tr产品（C端截短的d/n-ATF5)的生物活性。使用 Lipofectamine2000(Invitrogen)将 24 孔板内的纯化pQC-eGFP-d/n-ATF5_tr、全长 pQC-eGFP-d/n-ATF5阳性对照质粒或pQC-eGFP阴性对照质粒转化为大鼠C6神经胶质细胞。 48小时后，用DAPI染色细胞，然后用40x荧光显微镜观察10个随机场。将显示出破碎的凝 聚染色质的细胞记为细胞凋亡并确定相对于总细胞数的数量（n= 3个独立实验）。
[0100] 细胞穿透（CP)-6xHis-Pen-Flag-tagged-d/n_ATF5生物测定。对于肽生物测 定，大鼠C6成胶质细胞瘤细胞保存在无血清DMEM中2小时，然后放入不含或含有3yM Penetratin(Pen) -d/n-ATF5-RP肽或（Penetratin)Pen-对照-RP的DMEM/0. 5 %FBS中。5 天以后，用DAPI染色细胞，如上文所述确定凋亡细胞的百分比。
[0101] 内化Pen-d/n-ATF5-RP(重组蛋白）的成像。将大鼠C6细胞（来自JeffBruce;纽 约哥伦比亚大学；2004年，通过移植入大鼠脑部得到认证，Angelastro等，Oncogene2006 ; 25(6) :907-16)和U87细胞（购自ATCC并通过ATCC的认证）放在涂有连接蛋白的共焦显微 镜盖玻片上，存放一整晚。向孔内各添加3yMPen-d/n-ATF5-RP或Pen-对照-RP，培养1小 时、2小时、4小时或24小时。用PBS冲洗细胞3次以除去细胞外的肽，用原发性小鼠抗-FLAG 抗体（Sigma-Aldrich)进行整晚染色，然后与继发性抗小鼠Alexa-568(Invitrogen) -起 培养2小时。显微镜使用具有Axiocam视频捕捉的卡尔蔡司Axiovert200或者由Huygens DeconvolutionSoftware增强的O.l-ym光段DeltaVisionDeconvolution显微镜。用 xy平面图像和yz平面图像确定Pen-d/n-ATF5-RP和DAPI着色的共定位。
[0102] 逆转录病毒诱导的小鼠成胶质细胞瘤模型以及用Pen-d/n-ATF5_RP进行治疗。如 前所述（Arias等，Oncogene2012 ;31 (6) :739-51)，将成年小鼠麻醉，对其立体定向注射表 达TOGF-B和p53-shRNA的逆转录病毒，使其产生恶性神经胶质瘤。手术后立即给予镇痛剂。 对被注射的小鼠进行术后监测，整个研究周期为52至438天。在皮下注射或腹腔内注射治 疗中，对携带肿瘤的动物间隔1-2小时施用Pen-d/n-ATF5-RP或Pen-Control-RP。每次注 射剂量为lmg/kg(200yl，0.9%生理盐水）。在一些实施例中，5天以后重复定量给药。将 以相同给药方案和体积注射〇. 9%生理盐水的动物作为对照。
[0103] 脑切片与染色。如前所述，（Arias等，Oncogene2012 ;31 (6) :739_51)，用异氟醚 对小鼠深度麻醉实施安乐死，随后经心脏注射10%福尔马林。将脑固定在4%多聚甲醛中， 在30%蔗糖中培养整晚，然后放入0CT介质中，冷冻，切成14-ym的冠状面。在所述的另一 些情况中，将注射后小鼠的脑部放在10%福尔马林/PBS中培养4-7天，然后用石蜡包埋。 对石錯切片进行所述的抗原修复（Schrot等，JNeurooncol2007;85(2) :149_57)。用DAPI 和以下物质染色切片：抗-FlagM2(l: 200;Sigma-Aldrich)、兔抗-Flag(l: 1000，Cell Signaling)、兔抗-HA(4μg/ml;sc_805SantaCruzBiotechnology)或者TUNEL(Roche)和 抗-FlagM2。用DAPI过滤器和免疫荧光（Alexa488/568;Invitrogen)显现切片，或者用 氨基联苯胺或固红（Mach2;BiocareMedical)由比色法显现切片，并且用Axiocam摄像机 在卡尔蔡司Axiovert200显微镜上拍照。
[0104]MRI分析。给被麻醉（异氟醚和氧气）的小鼠静脉内安装直径30的导液管，头部先 固定，俯卧在扫描台上。在具有综合补偿控制的BrukerBiospec7特斯拉磁体上进行MRI 造影，该磁体运行Paravisionv5. 1并配有116-mm直径的梯度。最大梯度场强为450mT/m。 使用交叉线圈结构对脑部进行成像，使用72-mmID线性线圈进行射频传输，使用4通道相 控阵线圈进行射频接收。用FLASH_3Dslab获取1分钟前后的对比图像。按体重1y1/g的 剂量静脉注射钆。
[0105] 5. 1.2 结果
[0106]细朐穿诱形式的d/n-ATF5的牛成。如本f所沭制备可以通讨全身给药的修饰的 细胞穿透形式的d/n-ATF5。其潜在的优势是生物分布速度快、可降低免疫反应、可穿过血脑 屏障进入细胞，可以到达广泛分布的肿瘤细胞。原生d/n-ATF5是N-端截短形式的ATF5， 其包括具有两亲的a-螺旋序列的野生型亮氨酸拉链结构域，序列上每第七个残基上的亮 氨酸重复取代DNA结合域[Angelastro等，JNeurosci2003;23(11) :4590_600]。得到的 蛋白质能够与ATF5及其结合伴侣通过增强的亮氨酸拉链结构域相互作用，但不能与DNA 相互作用，因此充当了ATF5功能的有效d/n抑制因子[Angelastro等，JNeurosci2003 ; 23(11) :4590-600;Vinson等，GenesDev1993 ;7(6) :1047-58]。N-端结构域的删除基本 上使d/n_ATF5 稳定而不会发生老化[Lee等，DevelopmentalNeurobiology2012 ;72 (6): 789-804;Uekusa等，BiochemBiophysResCommun2009 ;380 (3) :673_8]。为了设计出可 传送形式的d/n-ATF5,蛋白质的最后25个氨基酸首先被截短，其中包括C-端两个缬氨酸/ 七缬氨酸重复。这种被删除的构造物被转染入C6成胶质细胞瘤细胞，在促使细胞凋亡方面 显示出与全长d/n-ATF5相同的效力（图1)。
[0107]为了生成细胞穿透形式的C-端截短d/n-ATF5 (d/n-ATF5_tr)，N-端带Flag标签 的d/n-ATF5-tr构造物的N-端被融合到6x组氨酸重复上，然后设计出penetratin序列 (图2A)。Penetratin序列为来自触角足基因同源域蛋白的16-氨基酸基序，该蛋白容许 所携带的融合物穿过生物膜进入细胞[Dupont等，Methodsinmolecularbiology2011 ; 683:21-9.]。通过在细菌中表达生成几毫克的蛋白质（指定Pen-d/n-ATF5-重组蛋白 (RP))，然后用6xHis序列通过钴亲和色谱法纯化。SDS-PAGE显示，纯化制品与看起来是聚 合蛋白质多聚体的低级物种的同族性超过95%。N-甲酰甲硫氨酸的Pen-d/n-ATF5-RP在 除去正常菌群后计算出的Mr为12, 949. 18Da，但是纯化副产物由SDS-PAGE显示出表观分 子量在25-28KDa之间（图2A)。野生型ATF5和ATF5亮氨酸拉链在进行SDS-PAGE时可发 生异常迀移，因此使用高分辩率LC-HRMS来验证Pen-d/n-ATF5-RP的正确分子量及其溶液 状态。去卷积谱显示，最多的类型是预测的12,948. 7Da单体，少量的是25,897. 5Da二聚 体（图2B)。此前的研究已经说明重组野生型全长ATF5或ATF5的bzip(碱性亮氯酸拉 链）结构域可以体外形成二聚体。最后，作为Pen-d/n-ATF5-RP的对照，用类似的方法生成 没有d/n-ATF5-tr的肽（Pen-Control-RP)(图2A)。纯化重组对照物（计算出的分子量为 7, 099. 98Da)在SDS-PAGE作用下在表观分子量（MW)为7, 100Da时发生迀移（图2A)。
[0108] 由于Pen-d/n-ATF5_RP是设计用于全身给药，37°C时在人血清存在的情况下稳定 性8小时未出现明显下降，48小时全长蛋白平均损失28%。（图2C)。
[0109]Pen-d/n-ATF5-RP怏谏讲入细朐引起培养的成胶质细朐瘤细朐凋亡。讲行动物卖 验之前，Pen-d/n-ATF5-RP进入并杀死培养物中成胶质细胞瘤细胞的能力已得到证实。当 加入到含大鼠C6血清和人U87成胶质细胞瘤的培养物中后，2-4小时之内很容易检测到 Pen-control-RP和Pen-d/n-ATF5-RP，并且保持可被检测到状态持续至少24小时（图3A、 图3B)。共焦显微镜显示在细胞质区和细胞核区都出现了这种肽（图3A)。
[0110] 对暴露于Pen-对照-RP和Pen-d/n-ATF5-RP的C6培养物也进行了对于凋亡性细 胞死亡的评定。经Pen-对照-RP处理的培养物显示了凋亡性死亡的背景水平与未经治疗 培养物相似，但是经Pen-d/n-ATF5-RP处理的培养物显示出死亡细胞的数量大大提升（图 4)。这种现象与之前描述的多种啮齿目动物及人类成胶质细胞瘤被d/n-ATF5构造物转染 或暴露于ATF5siRNA的现象相类似[Angelastro等，Oncogene2006 ;25 (6) :907_16;Arias 等，Oncogene2012 ;31 (6) :739-51;Sheng等，NatMed2010; 16(6) :671-7;Dluzen等，The Journalofbiologicalchemistry2011；286(9) ：7705-13]〇
[0111] 全身给药的Pen-d/n-ATF5-RP穿讨血脑屏障，讲入细朐并有诜择地怏谏引发神经 胶质瘤细朐的诜择件凋亡件死亡。格PDGF-B-HA/shRNA-p53逆转录病毒立体定位注射入成 年小鼠脑内而产生神经胶质瘤，建立这样一个模型来测试Pen-d/n-ATF5-RP到达并治疗原 发性脑肿瘤的能力。肿瘤很可能源自内生分化祖细胞并十分类似于II-IV期的浸润性人神 经胶质瘤。早在注射后52天即可通过MRI检测到肿瘤（见下