86] 4. 2免疫荧光染色检测EV71抗原表达
[0087] HBMEC细胞感染病毒后继续培养48h，采用免疫荧光法检测病毒抗原的表达，具体 步骤如下：
[0088] 1)细胞固定：将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，每孔加入100 μ 1 预冷甲醇，于-20°C条件下固定20min，用预冷的PBS清洗细胞3次。
[0089] 2)透膜：固定后的细胞每孔加入100 μ 1 0. 1% TritonX-100,室温孵育15min，用 预冷PBS洗涤3次。
[0090] 3)封闭：每孔加入100 μ 1 3% BSA，于室温下孵育lh。
[0091] 4) 一抗孵育：每孔加入EV71特异性鼠源单抗1(M) (1:2000稀释）100 μ 1，室温孵 育lh，用预冷的PBS洗涤3次。
[0092] 5)二抗孵育：每孔加入AF 488荧光标记抗鼠 IgG(l: 1000稀释）100 μ 1，室温避光 孵育lh，用预冷的PBS避光洗涤2次。
[0093] 6)标记细胞核：每孔加入细胞核荧光染料DAPI (1:5000, PBS稀释），室温避光孵育 15min，用预冷的PBS避光洗涤3次。
[0094] 7)荧光显微镜下检测并计算绿色AF 488阳性细胞克隆数。4. 3蛋白免疫印迹。
[0095] (1)用蛋白裂解液分别提取对照组与ARF6干扰组HBMEC细胞的总蛋白。
[0096] (2)蛋白质定量后分别将30ug蛋白加到12. 5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并 截取相应条带用电转仪转到PVDF膜上。
[0097] (3)蛋白的非特异性位点用5%的脱脂牛奶封闭，然后用特异性一抗封闭，4°C过 夜，用TBST缓冲液洗三遍，洗去一抗。
[0098] (4)然后用HRP标记的二抗室温孵育2小时，继而用TBST缓冲液洗三遍。
[0099] (5)最后，利用显色液显色并拍照分析·
[0100] 4. 4RT-PCR检测细胞中EV71病毒量
[0101] HBMEC细胞感染病毒后继续培养48h，采用TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总 RNA，并逆转录获得cDNA，通过RT-PCR检测EV71病毒量。具体步骤同2. 2所示。
[0102] 实验结果：
[0103] 1设计、合成并筛选有效的siRNA
[0104] 针对各个目的基因序列，我们设计了多个RNA干扰靶点序列，并利用设计软件进 行预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干 扰序列，如表1所示。
[0105] 采用体外转染的方法，将各个基因的干扰RNA转染到HBMEC细胞中去，48h后通过 RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，最终筛选到干扰效果最佳的siRNA序列进行后续实 验，其干扰效率如表2所示。
[0106] 表2 RT-PCR法检测siRNA干扰序列对相关宿主基因的下调效率
[0110] NT :转染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 细胞组（阴性对照组）
[0111] siRNA :转染针对各目的基因的siRNA的HBMEC细胞组（实验组）。
[0112] 2siRNA干扰后的干扰效率以及细胞毒性检测
[0113] 挑选出的针对各宿主分子的有效siRNA转染HBMEC细胞，转染后48h通过RT-PCR 法检测各干扰RNA的干扰效率，同时采用CCK8检测转染后对HBMEC细胞毒性的影响。
[0114] 结果如图1所示，转染有效siRNA组与CTRL组相比，转染各siRNA后能够明显抑 制相应基因的表达水平（P < 0. 01)。细胞毒性实验表明，各SiRNA转染后并没有产生明显 的细胞毒性（P > 〇. 05)，对细胞正常的生理功能未产生影响，可用于后续实验。
[0115] 3siRNA干扰后对EV71病毒感染的影响
[0116] 转染各宿主分子的有效siRNA来下调宿主细胞相关分子的表达后，感染相同剂量 的EV71病毒，感染48h后，采用免疫荧光法检测各宿主分子下调后对EV71感染的影响，发 现与对照组相比，转染EFS siRNA(SEQ ID N0:18)以及转染FYN siRNA(SEQ ID N0:22)分 别使EFS与FYN基因下调后，明显降低了 EV71对HBMEC细胞的感染（图2A)。通过计算病 毒量发现，EFS基因下调后对病毒的抑制率达到77%，FYN基因下调后对病毒的抑制率达到 86 %而其余分子的下调并没有明显抑制EV71对HBMEC细胞的感染（P > 0. 05)(图2B)。
[0117] 为明确EFS对EV71感染的抑制作用，在转染EFS分子siRNA后，通过免疫印迹法 检测EFS蛋白分子的表达，并在感染EV71后观察细胞病变情况，以及通过RT-PCR检测EV71 病毒量。结果显示，转染EFS分子siRNA(SEQ ID N0:18)后，能够明显抑制发现EFS蛋白分 子的表达（图3A)。与对照组相比，EFS蛋白表达下调后，能够抑制细胞病变且HBMEC细胞 中的病毒量也显著下降（图3B，C)，与免疫荧光法检测结果相一致。这些结果表明，与对照 细胞相比，下调EFS基因后EV71对HBMEC细胞的感染能力明显下降，病毒量减少。
[0118] 进一步，分别转染三条EFS分子的siRNA观察对病毒感染性的影响。结果表明不 同的siRNA对EFS分子的下调效率不同（图4A)，其中siRNA (SEQ ID N0:18)的干扰效率最 高，与前面的结果相一致。检测干扰后对EV71感染性的影响发现，三条EFS分子的siRNA对 病毒感染的抑制率均可达到60%以上，而且随着对EFS分子的下调效率的增高，对EV71感 染的抑制率也在升高（图4B)，提示EFS分子在EV71感染HBMEC中的重要作用。因此，EFS 可作为抑制EV71对HBMEC细胞感染的新的宿主靶点。
[0119] 为明确FYN对EV71感染的抑制作用，在转染FYN分子siRNA后，通过免疫印迹法 检测FYN蛋白分子的表达，并在感染EV71后观察细胞病变情况，以及通过RT-PCR检测EV71 病毒量。结果显示，转染FYN分子siRNA(SEQ ID N0:22)后，能够明显抑制发现FYN蛋白分 子的表达（图5A)。与对照组相比，FYN蛋白表达下调后，能够抑制细胞病变且HBMEC细胞 中的病毒量也显著下降（图5B)，与免疫荧光法检测结果相一致。这些结果表明，与对照细 胞相比，下调FYN基因后EV71对HBMEC细胞的感染能力明显下降，病毒量减少。
[0120] 进一步，分别转染三条FYN分子的siRNA观察对病毒感染性的影响。结果表明不 同的siRNA对FYN分子的下调效率不同（图6A)，其中siRNA (SEQ ID N0:22)的干扰效率最 高，与前面的结果相一致。检测干扰后对EV71感染性的影响发现，三条FYN分子的siRNA对 病毒感染的抑制率均可达到60%以上，而且随着对FYN分子的下调效率的增高，对EV71感 染的抑制率也在升高（图6B)，提示FYN分子在EV71感染HBMEC中的重要作用。因此，FYN 可作为抑制EV71对HBMEC细胞感染的新的宿主靶点。
[0121] 通过以上实验结果证明：本发明筛选到能够抑制EV71感染HBMEC细胞的新的宿主 细胞分子FYN以及EFS。FYN或EFS基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑 制了 EV71对HBMEC细胞的感染。因此本发明为临床预防和治疗因 EV71感染所导致的血脑 屏障的失能提供了新的靶点和治疗方案。
[0122] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。2. 蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制备预防或治疗手足口病药物中的应用。3. 根据权利要求1所述的蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制备预防或治疗肠道病毒71 型感染药物中的应用，其特征在于，所述的药物为能够抑制或下调FYN表达量的试剂。4. 根据权利要求3所述的蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制备预防或治疗肠道病毒71 型感染药物中的应用，其特征在于，所述的抑制或下调FYN表达量的试剂是siRNA、shRNA或 包含siRNA、shRNA的重组载体。5. 根据权利要求1所述的蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制备预防或治疗肠道病毒71 型感染药物中的应用，其特征在于，所述药物为FYN的干扰RNA，所述的干扰RNA的序列选自 以下任一： GCUCUGAAAUUACCAAAUCUU(SEQIDN0:22)、 AUGAAUUAUAUCCAUAGAGAU(SEQIDN0:23)、 GCCUCUUUGUCUAAAACAAUA(SEQIDN0:24)。6. 根据权利要求2所述的蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制备预防或治疗手足口病药物 中的应用，其特征在于，所述的药物为能够抑制或下调FYN表达量的试剂。7. 根据权利要求6所述的蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制备预防或治疗手足口病药物 中的应用，其特征在于，所述的抑制或下调FYN表达量的试剂是siRNA、shRNA或包含siRNA、 shRNA的重组载体。8. 根据权利要求2所述的蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制备预防或治疗手足口病药物 中的应用，其特征在于，所述药物为FYN的干扰RNA，所述的干扰RNA的序列选自以下任一： GCUCUGAAAUUACCAAAUCUU(SEQIDN0:22)、 AUGAAUUAUAUCCAUAGAGAU(SEQIDNO:23)、 GCCUCUUUGUCUAAAACAAUA(SEQIDNO:24)。
【专利摘要】本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。本发明以人脑微血管内皮细胞(HBMEC)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的宿主因子，从而保护血脑屏障的功能，预防病毒穿过血脑屏障感染中枢神经系统。本发明通过实验发现蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因(FYN？proto-oncogene,Src？family？tyrosine？kinase)分子在EV71感染HBMEC中发挥着重要的作用，下调FYN的表达，能明显抑制EV71的感染。本发明提供了FYN在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。
【IPC分类】C12Q1/68, A61P31/14, A61K48/00, A61K31/7088
【公开号】CN105288654
【申请号】CN201510033891
【发明人】朱勇喆, 戚中田, 徐庆强, 赵平, 陈生林
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年1月23日