，G.以及Greig，R. (1988).人类结肠直肠癌细胞系中的生物表征和癌基因表 达(Biological characterization and oncogene expression in human colorectal carcinoma cells lines).International Journal of Cancer 41:287_296〇
[0219] 样品制备
[0220] 将测试项目以下表中所给出的浓度溶解于15%乙醇（ΕΤ0Η)/汉克斯平衡盐溶液 (Hanks Balanced Salt Solution，HBSS)中〇
[0221] 表4 :这个方案中所用的测试样品的浓度
[0224] 50倍稀释样品#4以得到2mg/mL固含量的工作储备溶液。
[0225] 样品#2、#3以及#5是粉末。通过称重2mg并且溶解于1ml 15% ET0H/HBSS中来 制备工作储备溶液。
[0226] 实验程序
[0227] 测试系统的表征
[0228] 1.人类结肠直肠腺癌细胞（ATCC CC1-221，DLD_1)。
[0229] 2.青霉素-链霉素溶液：含10000单位/毫升青霉素、10mg/ml链霉素的0.9 % NaCl (Sigma 目录号 P-0781)。储存于-20°C下。
[0230] 3. DMEM 培养基（Invitrogen 目录号 12100-046)。储存于-20°C下。
[0231] 4.胰蛋白酶-EDTA溶液：0· 25 %胰蛋白酶/EDTA，Invitrogen目录号 15400054 (X 10,于储备液中）。
[0232] 5.磷酸盐缓冲盐水（PBS)(由TBL制备）。
[0233] 6.汉克斯平衡盐溶液（HBSS) (GIBC0目录号14185-052)。储存于4°C下。
[0234] 7.胎牛血清（GIBC0目录号10091-148)。储存于-20°C下。
[0235] 8· MTT试剂：100mg/小瓶（SIGMA目录号M-2128)，以10mg/ml溶解于PBS中并且 储存于_20°C下。在PBS中制备5mg/ml MTT溶液并且储存于4°C下作为工作溶液。
[0236] 9. MTT裂解缓冲液：10%十二烷基硫酸钠（SDS)/45%二甲基甲酰胺（将20g SDS 溶解于l〇〇ml双蒸馏水（DDW)中，并且将90ml二甲基甲酰胺添加至SDS溶液中）。用冰醋 酸将pH调整至4. 7,并且添加 DDW直至200ml的最终体积。
[0237] 10. 5-氟尿嘧啶（5-FU) (Sigma 目录号 F-6627)。以 150ng/ml 和 75ng/ml 制备两 种工作溶液，溶解于15%乙醇/耶55中。最终浓度为7.50即/1111和3.751^/1111。
[0238] 培养基制备
[0239] 用于繁殖结肠直肠腺癌（DLD-1)细胞的培养基是补充有青霉素-链霉素溶液（10 毫升/升）的DMEM。在即将使用之前添加 FBS以得到10% w/v。
[0240] 细胞培养
[0241] 1.使获自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection USA)的人类 结肠直肠腺癌细胞（DLD-1)从冷冻储存中复活。
[0242] 2.在使用上文所描述的培养基（参看培养基制备）进行初始繁殖之后，如下使用 胰蛋白酶-EDTA对培养物进行次培养。去除培养基并且添加5ml胰蛋白酶-EDTA溶液，并 且在37°C下孵育5分钟或直至所有细胞都已经脱落。通过添加等体积的DMEM培养基来中 和胰蛋白酶，并且在4°C下使培养物以300g(1200rpm)离心5分钟。
[0243] 3.倾析上清液，并且使细胞团块再悬浮于培养基DMEM、FBS(10% )、青霉素 （100单 位/毫升）、链霉素 （l〇〇μg/ml)中。在37°C下于5%C02/95%空气中培养细胞。
[0244] 4.在达到汇合之后，如上文2中所描述使用胰蛋白酶-EDTA使细胞脱落并且离心。
[0245] 5.弃去上清液，并且如上文3中所描述以7. 5 X 104个细胞/毫升使细胞再悬浮于 DMEM和补充物中。需要23ml总体积的细胞悬浮液。
[0246] 6.如下文的板布局中所指示，向96孔板的每个孔中添加180 μ 1细胞（13, 550个 细胞/孔）或培养基。将板在5% C02/95%空气中于37°C下孵育8小时，这足以允许细胞 强有力地附着。
[0247] 7.如上文的图表中所指示，向每个孔中添加20 μ 1测试样品或阳性对照中的每一 者。向标记为'培养基'或'仅细胞'的孔中添加20 μ 1 15% ET0H/HBSS。以6个重复测定 来评估每个样品，而以9个重复测定（组合的三重测定）来评估所有三个板上的对照。
[0248] 8.每个孔中的总体积为200 μ 1。
[0249] 9.将板在37°C下于5% C02/95%空气中孵育19小时。
[0250] 细胞增殖试验
[0251] 1.在孵育完成时，将20 μ 1 MTT工作溶液（5mg/ml)添加至所有孔中，并且在37°C 下于5% C02/95%空气中孵育2小时。
[0252] 2.然后添加 100μΙ MTT裂解缓冲液，并且将板在37°C下在振荡器上于5% C02/95%空气中孵育3小时，继而移液以破碎并溶解晶体直至完全溶解。使板以1200rpm离 心10分钟以使任何剩余的不可溶物质成团。将200 μ 1等分试样从每个孔转移至新的96 孔板中。在570nm下用VersaMax微板读取器读取板。
[0253] 3.结果表示为与仅细胞对照相比在样品存在下培养的细胞的增殖百分比。从所有 孔扣除作为背景读数的空白读数。
[0254] 结果和讨论
[0255] 对照和测试样品对细胞增殖的影响的汇总呈现于表5和图1中。
[0256] 表5 :测试样品对DLD-1细胞增殖的影响
[0257]
[0259] NS =不显著。
[0260] 在储备细胞培养物的生长期间所观测到的细胞的相对快速增殖速率允许细胞与 测试样品的孵育时间缩减至8小时。如在与MTT反应之后对照培养物的色彩强度（平均 0D57(]nni= 0.7047)所评估，这证实相当令人满意。以六个重复测定分析每个样品。在六个样 品内存在良好的一致性，使得所有重复测定的SEM在预期限度内并且所有六个都用于计算 平均吸光度值。对于对照（阴性与阳性），九个重复测定是充分一致的以用于统计学评价。
[0261] ⑶1环糊精蜂胶复合物
[0262] 200 μ g/ml环糊精蜂胶复合物是结肠癌细胞增殖的统计上显著的抑制剂。其使增 殖减少23. 9%。
[0263] CD2环糊精蜂胶+CAPE
[0264] 200 μ g/ml制剂环糊精蜂胶+CAPE作为细胞生长的抑制剂也是统计上显著的。其 使增殖减少28. 2%。
[0265] 25 %蜂胶酊剂
[0266] 200 μ g/ml浓度的25%蜂胶酊剂是结肠癌生长的统计上显著的抑制剂。其使增殖 减少24. 9%。
[0267] CAVAMAX W8 Food γ -环糊精
[0268] 在200 μ g/ml下，CAVAMAX W8 Food γ -环糊精对细胞增殖产生不显著的影响，仅 减少9. 1 %。
[0269] 在这项研究中，7. 5ng/ml 5-氟尿嘧啶对生长产生不显著的6. 7%抑制。这是意想 不到的。基于先前的研究，预期在这种浓度下，将记录统计上显著的减少。
[0270] 以等效质量为基础对测试材料进行上文所描述的试验。因此，对于测试材料的最 终浓度为200 μ g/mL的原生蜂胶酊剂，整个200 μ g包含蜂胶固体。环糊精复合物至多含有 25%蜂胶，并且因此200 μ g中仅50 μ g包含蜂胶。如图1中清楚可见并且如上文所观测， 观测到原生蜂胶（酊剂除外）和蜂胶/γ-环糊精组合物的大致相同活性。因此，这个数据 表明，本发明的蜂胶/γ-环糊精组合物的这个实施例与原生蜂胶相比在这个试验中展现 约四倍的活性，这是因为复合物中蜂胶固体的含量仅为50 μ g/mL(参看图1Β)。
[0271 ] 下表6和图1B示出了每个含蜂胶样品的功效％，其中功效％ =抑制％ /样品中蜂 胶的浓度。
[0272] 表6.测试样品的功效
[0274] 本申请者还注意到，使存在于环糊精复合物中的CAPE的量加倍仅略微增加生物 活性，这表明在这种浓度下的CAPE对增殖没有很大影响。
[0275] 这些数据支持了本发明组合物与蜂胶相比的增强功效。在不希望受任何理论约束 的情况下，本申请者提出这可能归因于由蜂胶和环糊精组合物展现的对结肠直肠细胞增殖 的意想不到的协同作用。
[0276] 实施例3
[0277] 这个实施例示出了环糊精包封的蜂胶与CAPE、白杨素以及高良姜素的纯标准相比 的有效性。针对实施例2中所用的相同的人类结肠直肠腺癌细胞系DLD-1测试所有样品。
[0278] 材料和方法
[0279] 测试方法和实验程序与实施例2中所用的那些相同。CAPE、高良姜素以及白杨素 标准以高于99%的纯度获自Sigma-AldriCh。CAPE、白杨素以及高良姜素浓度在表7中给 出。
[0280] 表7 :CAPE、白杨素以及高良姜素的测试浓度
[0281]
[0282] 除非表8中有指定，在200 μ g/ml的孔浓度下测试以下样品。
[0283] 结果和讨论
[0284] 表8 :环糊精复合物和纯化合物对DLD-1细胞增殖的影响
[0287] 如表8中所示，CAPE、白杨素以及高良姜素标准在200 μg/ml的浓度下全部是 DLD-1增殖的统计上显著的抑制剂。当这些化合物以低得多的浓度存在于环糊精复合物中 时，增殖也是显著的。相对抑制（抑制％与浓度的比率）对比测试物质浓度示于图2中。
[0288] 结果显示，含有这三种化合物的蜂胶包封于环糊精中大大增加其活性。
[0289] 实施例4
[0290] 这个实施例展示了本发明的组合物环糊精包封的蜂胶诱导人类结肠直肠癌细胞 系HCT-116的凋亡，以及加强丁酸盐在这种人类结肠直肠癌细胞和对丁酸盐具抗性的癌细 胞系HCT-116R中的凋亡作用的能力。丁酸是由肠菌群通过可溶性纤维的消化而产生。
[0291] 材料和方法
[0292] 细胞培养物和化学品
[0293] 人类结肠直肠细胞系HCT-116获自美国菌种保藏中心（Rockville，MD)。如先 前在Bordonaro M，Lazarova DL，Sartorelli AC.由Wnt信号传导活化β-连环蛋白介 导组蛋白脱乙酰酶抑制剂的作用（The activation of beta-catenin by Wnt signaling mediates the effects of histone deacetylase inhibitors). Exp Cell Res. 2007 ； 313:1652-66 (包括其中的参考文献）中所描述，丁酸盐抗性细胞系是从HCT-116通过在渐 增浓度的丁酸盐中培养亲本细胞而得到。
[0294] 使结肠直肠细胞在具有10%胎牛血清和抗生素的α-MEM培养基中生长。蜂 胶-环糊精复合物⑶1中CAPE的浓度为1. 79 μ g/100 μ g包封于环糊精中的蜂胶固体，或 0. 41 μ g/100 μ g环糊精复合物。在二甲亚砜中制备储备溶液，丁酸盐除外，其以1M浓度溶 解于水中。
[0295] 凋亡试验
[0296] 在处理之前二十四小时，将结肠癌细胞以每孔100, 000-120, 000涂于24孔板 中。将仅细胞的阴性对照与暴露于5mM 丁酸盐的阳性对照、1. 2 μ g/ml CAPE、5mM 丁酸盐 +1，2 μ g/ml CAPE、100 μ g/ml蜂胶-环糊精、或5mM 丁酸盐+100 μ g/ml蜂胶-环糊精持续 50小时的细胞相比较。收集所有细胞（浮动和附着的）并且使用PE膜联蛋白V凋亡检测 试剂盒I(BD Biosciences, #559763)针对凋亡和坏死标志进行染色。使用FACS Aria II 和DiVa软件进行流式细胞术分析。凋亡百分比是凋亡细胞的数目除以所有分析细胞的数 目并且乘以100。
[0297] 统计学
[0298] 所有数据呈现为来自至少三组独立实验的平均值土标准偏差。使用司徒登T检 验（Student T-test)分析来确定统计差异的显著性。在Ρ〈0. 05时，差异被视为显著的。
[0299] 结果
[0300] 丁酸盐对结肠癌细胞的凋亡作用由CAPE和蜂胶不同程度地加强。
[0301] 利用HCT-116和HCT-R细胞来比较丁酸盐、CAPE和蜂胶-环糊精复合物以及丁酸 盐与CAPE或蜂胶环糊精的组合的凋亡作用。在针对阴性对照标准化之后结果示于表9和 图3中。
[0302] 表9 :纯化合物、蜂胶γ环糊精复合物⑶1以及其与丁酸盐的混合物对HCT-116和 HCT-116R细胞凋亡的作用
[0305] 暴露于CAPE的HCT-116细胞相对于阴性对照的凋亡没有显著增加。尽管蜂胶-环 糊精复合物仅具有约1/4的CAPE，但暴露于蜂胶-环糊精复合物⑶1的HCT-116细胞相比 阴性对照经历约8%的显著水平的凋亡（参看图3)。HCT-116细胞的丁酸盐处理相对于仅 细胞引起35%凋亡。CAPE或蜂胶-环糊精与丁酸盐的组合增加丁酸盐所达成的HCT-116 细胞的凋亡。CAPE与丁酸盐的组合相对于仅细胞引起52%凋亡（与单独的丁酸盐相比， P〈0. 05)。尽管仅具有1/4的CAPE，但蜂胶-环糊精与丁酸盐的组合相对于仅细胞引起58 % 凋亡（与单独的丁酸盐相比，P〈0. 05)。当用单独的丁酸盐（如预期）或单独的CAPE测试 时，HCT-R细胞并不经历显著凋亡；然而，暴露于蜂胶-环糊精复合物相对于11 %的阴性对 照引起显著更高水平的凋亡，P〈〇. 05。CAPE或蜂胶-环糊精与丁酸盐的组合使HCT-R细胞 对丁酸盐的凋亡作用重新敏感。CAPE与丁酸盐的组合相对于对照引起12%凋亡（与单独 的丁酸盐相比，P〈〇. 05)。蜂胶-环糊精复合物与丁酸盐的组合相对于对照使凋亡进一步增 至33% (与单独的丁酸盐相比，Ρ〈0· 05)。
[0306] 讨论
[0307] 这个实施例显示，单独测试的咖啡酸苯乙酯（CAPE)和含有1/4量的CAPE的蜂 胶-环糊精复合物对人类结肠癌细胞的凋亡发挥差别作用。蜂胶-环糊精组合物以比CAPE 大得多的程度增加暴露于丁酸盐的结肠癌细胞的凋亡，CAPE在所用浓度下本身是无效的。 此外，蜂胶-环糊精复合物在使丁酸盐抗性HCT-R细胞对丁酸盐诱导的凋亡重新敏感方面 比CAPE更强效。
[0308] 预期含有可由肠菌群消化的可溶性纤维的膳食将原位产生丁酸盐，并且结肠癌细 胞可以对以这样的方式产生或通过其它方式施用的丁酸盐因长期暴露而变成抗性。这个实 施例展示了在不存在与存在第二凋亡剂的情况下本发明的组合物调节原生与丁酸盐抗性 结肠直肠癌细胞的凋亡的功效；并且本发明的组合物可以逆转结肠直肠细胞对由这类药剂 诱导的凋亡的抗性。这些结果支持了本发明的组合物治疗和预防胃肠癌的功效。
[0309] 实施例5
[0310] 这个实施例展示了本发明的组合物γ-环糊精包封的欧洲型蜂胶抑制人类结肠 癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管 鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖的能力。下文示出了用于实施例5至8的一般方法。
[0311] 用于胃肠癌抗增殖试验的材料和方法
[0312] 如通过ΜΤΤ试验所评估，评估如实施例1中所制备的样品⑶5 γ -环糊精调节人类 结肠直肠腺癌细胞（DLD-1)、人类结肠癌细胞系（HCT-116)、人类胃癌细胞系（NCI-N87)以 及人类食管鳞状细胞癌细胞系（KYSE-30)的生存力和增殖的能力。在研究中除了未补充的 细胞对照作为阴性对照之外，还包括三种浓度的阳性对照5-氟尿嘧啶（5-FU)。[我们包括 用于比较的测试化合物吗？]
[0313] 测试材料和测试方法的描述
[0314] 使四种人类胃肠癌细胞系从冷冻储存中复活并且在测试和参考样品存在下培养。 然后对培养物进行ΜΤΤ试验以确定样品对细胞生存力和增殖的影响。
[0315] 方法是基于上述实施例2中所概述的程序。
[0316] 样品制备
[0317] 将测试样品和实施例5至8中的所有其它测试样品溶解于15%乙醇/汉克斯平衡 盐溶液（ET0H)/HBSS中达到2mg/mL固含量的浓度。在试验中，样品的最终浓度为200 μ g/ ml并且最终EtOH浓度为1. 5 %。
[0318] 实验程序
[0319] 测试系统的表征
[0320] 1.人类结肠直肠腺癌细胞（ATCC CC1-221，DLD-1) (ATCC，Bethesda，MD，USA)
[0321] 2.人类胃癌细胞（ATCC CRL-5822，NCI-N87) (ATCC, Bethesda，MD, USA)
[0322] 3.人类食管鳞状细胞癌（ECACC, KYSE-30) (Sigma Aldrich, Auckland, NZ)
[0323] 4.人类结肠癌细胞（ECACC HCT-116) (Sigma Aldrich, Auckland, NZ)
[0324] 5.青霉素-链霉素溶液：含10000单位/毫升青霉素、lOmg/ml链霉素的0.9% NaCl (Sigma 目录号 P-0781)。储存于-20°C下。
[0325] 6.对于 DLD-1 细胞：DMEM 培养基（Invitrogen 目录号 12100-046)。储存于 4°C 下。
[0326] 7.对于NCI-N87细胞：经过修改以含有2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、lmM丙酮酸 钠、4500mg/L葡萄糖以及1500mg/L碳酸氢钠的RPMI-1640培养基（Sigma R6504)。储存于 4Γ下。
[0327] 8.对于KYSE-410细胞：经过修改以含有2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基 (Sigma R6504)。储存于 4°C下。
[0328] 9.对于HCT-116细胞：经过修改以含有2mM L-谷氨酰胺的麦考伊氏5A培养基 (McCoy's 5A medium) (Sigma M48792)。储存于 4°C 下。
[0329] 10.胰蛋白酶-EDTA溶液：0· 25 %胰蛋白酶/EDTA，Invitrogen目录号 15400054 (X 10,于储备液中）。
[0330] 11.磷酸盐缓冲盐水（PBS)(由TBL制备）。
[0331] 12.汉克斯平衡盐溶液（HBSS) (GIBC0目录号14185-052)。储存于4°C下。
[0332] 13.胎牛血清（GIBC0目录号10091-148)。储存于-20°C下。
[0333] 14. MTT 试剂：100mg/ 小瓶（SIGMA 目录号 M-2128)，以 10mg/mL 溶解于 PBS 中并且 储存于_20°C下。将在PBS中制备5mg/ml MTT溶液并且储存于4°C下作为工作溶液。
[0334] 15. MTT裂解缓冲液：10%十二烷基硫酸钠（SDS)/45%二甲基甲酰胺（将20g SDS 溶解于l〇〇mL双蒸馏水（DDW)中，并且将90mL二甲基甲酰胺添加至SDS溶液中）。用冰醋 酸将pH调整至4. 7,并且添加 DDW直至200mL的最终体积。
[0335] 16. 5-氟尿嘧啶（5-FU) (Sigma 目录号 F-6627)。将以 19. 5 μ g/ml、6. 5 μ g/ml 以及1. 95 μ g/ml制备三种工作溶液，溶解于15%乙醇/HBSS中。最终浓度将为1. 95 μ g/ ml (15 μΜ)、0· 65 μ g/ml (5 μ Μ)以及 0· 195 μ g/ml (1.5 μ Μ)。
[0336] 培养基制备
[0337] 上文给出了用于繁殖细胞系中的每一者的培养基。每种培养基是遵循ATCC/ECACC 说明书来制备并且补充有青霉素-链霉素溶液（10毫升/升）。在即将使用之前添加 FBS(以 10% ) 〇
[0338] 细胞培养
[0339] 1.使获自美国菌种保藏中心或欧洲细胞培养中心（European Collection of Cell Cultures)的细胞系中的每一者从冷冻储存中复活。
[0340] 2.在使用上文所描述的培养基（参看测试系统的表征和培养基制备）进行初始 繁殖之后，使用胰蛋白酶-EDTA对培养物进行次培养。去除培养基并且添加5mL胰蛋白 酶-EDTA溶液，并且在37°C下孵育5分钟或直至所有细胞都已经脱落。通过添加等体积的 相关培养基来中和胰蛋白酶，并且在4°C下使悬浮液以300g(1200rpm)离心5分钟。
[0341] 3.倾析上清液，并且使细胞团块再悬浮于含有FBS(10%)、青霉素（100单位/毫 升）、链霉素（100 μ g/ml)的相关培养基中。
[0342] 4.在达到汇合之后，如上文2中所描述使用胰蛋白酶-EDTA使细胞脱落并且离心。
[0343] 5.弃去上清液，并且如上文3中所描述