以1. OX 104个细胞/毫升使细胞再悬浮于 相关培养基和补充物中。需要约54ml总体积的每种细胞悬浮液。
[0344] 6.如预定的板布局中所指示，向六个96孔板的每个孔中添加180 μ 1细胞（1，800 个细胞/孔）或培养基。将板在5% C02/95%空气中于37°C下孵育约48小时以允许细胞 附着。
[0345] 7.如板布局所指示，向每个孔中添加20 μ 1测试化合物或5-FU中的每一者。对于 标记为'培养基'或'仅细胞'的阴性对照孔，添加20 μ 1 15% ETOH/HBSS。以3或6个重 复测定来评估每个样品或对照。
[0346] 8.每个孔中的总体积为200 μ 1。
[0347] 9.将板在37°C下于5% C02/95%空气中孵育24小时。
[0348] 细胞增殖试验
[0349] 1.在孵育完成时，将20 μ 1 MTT工作溶液（5mg/mL)添加至所有孔中，并且在37°C 下于5% C02/95%空气中孵育3-4小时。每隔30-60分钟监测板并且如果极少细胞显示晶 体的存在，那么如下文步骤2中添加裂解缓冲液。
[0350] 2.然后添加100 μ 1 MTT裂解缓冲液，并且将板在37°C下于5% C02/95%空气中 孵育过夜。使板以1200rpm离心10分钟以使任何剩余的不可溶物质成团。将200 μ 1从每 个孔转移至新的96孔板中。然后在550nm下用VersaMax微板读取器读取板。
[0351] 3.从所有孔扣除作为背景读数的空白读数。结果表示为与仅细胞对照相比在样品 存在下培养的细胞的增殖百分比。
[0352] 4.使用VersaMax 96孔板读取器以比色法（在550nm下）评估细胞的增殖。
[0353] 5.评估平均值的标准误差百分比并且如果SEM% >15,那么将去除极端界外值。将 用独立的司徒登t检验（Student t-test)在α < 〇· 05下（存在和不存在界外值下）评 估初步统计显著性。
[0354] 关于测试方法的观测
[0355] 在各种测试制剂和5-FU存在下进行几种癌细胞的培养持续48小时，届时在24小 时后DLD-1和NCI-N87的阴性对照的细胞密度的目视观测表明生长并不如预期一样快。为 了一致，将其它培养物的时间设定为相同的。
[0356] 研究计划要求如果平均值的标准误差（SEM)百分比大于15%，那么从计算中删除 重复测定当中的界外值。当样品是强拮抗剂时，吸光度值很小。因此，在这些当中的小变化 意指当与较小抑制性样品相比较时，用百分比表示的从平均值的变异相对较大。这使得发 生几乎完全抑制的一些界外值从分析中去除。
[0357] 结果
[0358] ⑶5γ_环糊精的细胞增殖试验的结果示于表10中，连同三种浓度的阳性对照 5-氟尿嘧啶（5-FU)，和阴性对照（仅细胞与培养基并且没有测试化合物或阳性对照）的结 果一起。在表中，0D是在570nm下测量的光密度；SEM是与所测量的平均光密度值相关的标 准误差；P是测量经由司徒登t检验是统计上显著的概率值，此处被视为〈0. 05 ;刺激％是 与阴性对照（测试化合物无活性）相比增殖的刺激百分比；抑制％是与阴性对照相比增殖 的减少百分比，其中大数字指示测试化合物具有抗癌增殖潜力。
[0359] 表10.⑶5 γ -环糊精包封的欧洲型蜂胶对4种胃肠细胞系的抗增殖活性
[0360]
[0362] 讨论
[0363] CD5 γ -环糊精对四种细胞系中的三种具高度活性，使得人类结肠腺癌细胞系 DLD-1的增殖抑制73. 0 %、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制79. 3 %、人类胃癌细胞系 NCI-N87的增殖抑制32. 7%以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制70. 5%。
[0364] 抑制程度类似于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶（5-FU)所达成的抑制程度，并且 对于NCI-N87确实是优良的。结果展示，γ-环糊精包封的欧洲型蜂胶对胃肠癌具有广谱 抗增殖活性。结果还确认了对实施例2至4中所展示的人类结肠腺癌细胞系DLD-1的抗癌 活性以及对实施例4中所展示的人类结肠癌细胞系HCT-116的抗癌活性。
[0365] 实施例6
[0366] 这个实施例展示了本发明的组合物α -环糊精包封的欧洲型蜂胶抑制人类结肠 癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管 鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖的能力。使用DLD-1、HCT-116、NCI-N87、KYSE-30的增 殖试验进行这项研究。
[0367] 按照实施例1制造试验中所用的200 μg/ml浓度的α-环糊精包封的欧洲型蜂 胶，测试物质CD6具有表2中所给出的组成。在实施例5中详细给出的相同测试程序也用 于实施例6。
[0368] 结果
[0369] α -环糊精包封的欧洲型蜂胶的抗增殖试验的结果示于表11中。仅细胞（阴性对 照）和5-FU阳性对照的结果与实施例5相同并且因此不包括于表中。
[0370] 表11.⑶6 α -环糊精包封的欧洲型蜂胶对4种胃肠细胞系的抗增殖活性
[0372] 讨论
[0373] CD6 α -环糊精对四种细胞系中的两种具中等活性，使得人类结肠腺癌细胞系 DLD-1的增殖抑制61. 7 %、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制57. 8 %、人类胃癌细胞系 NCI-N87的增殖抑制24. 6%以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制48. 7%。
[0374] 抑制程度类似于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶（5-FU)所达成的抑制程度。结果 展示，α-环糊精包封的欧洲型蜂胶对胃肠癌具有广谱抗增殖活性，但活性低于γ-环糊精 包封的欧洲型蜂胶。
[0375] 实施例7
[0376] 这个实施例展示了本发明的组合物β -环糊精包封的欧洲型蜂胶抑制人类结肠 癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管 鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖的能力。使用DLD-1、HCT-116、NCI-N87以及KYSE-30的 增殖试验进行这项研究。
[0377] 按照实施例1制造试验中所用的200 μg/ml浓度的β-环糊精包封的欧洲型蜂 胶，测试物质CD7具有表2中所给出的组成。在实施例5中详细给出的相同测试程序也用 于实施例7。
[0378] 结果
[0379] α -环糊精包封的欧洲型蜂胶的抗增殖试验的结果示于表12中。仅细胞（阴性对 照）和5-FU阳性对照的结果与实施例5相同并且因此不包括于表中。
[0380] 表12.⑶7 β -环糊精包封的欧洲型蜂胶对4种胃肠细胞系的抗增殖活性
[0382] 讨论
[0383] CD7 β -环糊精对四种细胞系中的两种具中等活性，使得人类结肠腺癌细胞系 DLD-1的增殖抑制62. 5 %、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制49. 6 %、人类胃癌细胞系 NCI-N87的增殖抑制21. 8%以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制42. 9%。 抑制程度类似于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶（5-FU)所达成的抑制程度。
[0384] 结果展示，β -环糊精包封的欧洲型蜂胶对胃肠癌具有广谱抗增殖活性，但活性低 于γ-环糊精包封的欧洲型蜂胶。
[0385] 实施例8
[0386] 这个实施例展示了本发明的组合物γ-环糊精包封的巴西型蜂胶抑制人类结肠 癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管 鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖的能力。使用DLD-1、HCT-116、NCI-N87以及KYSE-30的 增殖试验进行这项研究。
[0387] 按照实施例1制造试验中所用的200 μ g/ml浓度的γ -环糊精包封的巴西型蜂 胶，测试物质CD8。在实施例5中详细给出的相同测试程序也用于实施例8。
[0388] 结果
[0389] γ-环糊精包封的巴西绿型蜂胶的抗增殖试验的结果示于表13中。仅细胞（阴性 对照）和5-FU阳性对照的结果与实施例5相同并且因此不包括于表中。
[0390] 表13.⑶8 γ -环糊精包封的巴西绿型蜂胶对4种胃肠细胞系的抗增殖活性
[0392] 讨论
[0393] CD8 γ -环糊精对四种细胞系中的三种具中等至弱活性，使得人类结肠腺癌细胞系 DLD-1的增殖抑制18. 8%、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制24. 3%以及人类食管鳞 状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制21. 3%。人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖受到3. 4% 的刺激，但这种刺激不是显著的。
[0394] 除了对NCI-N87没有观察到作用以外，抑制程度类似于使用已知的抗癌剂5-氟尿 嘧啶（5-FU)所达成的抑制程度。结果展示，γ-环糊精包封的巴西绿型蜂胶对胃肠癌具有 相对广谱的抗增殖活性，但活性比γ-环糊精包封的欧洲型蜂胶低得多。
[0395] 实施例9
[0396] 这个实施例提供了欧洲型ΝΖ环糊精包封的蜂胶⑶8与巴西绿环糊精包封的蜂胶 CD9的抗食管癌活性的比较评估；以及亲本ΝΖ蜂胶干固体与巴西绿蜂胶固体以及与单独 的γ-环糊精的比较评估。使用人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验，使用实 施例5中所概述的一般方法进行这项研究。NZ蜂胶与在实施例1中制造复合物CD8所用 的相同。巴西绿蜂胶与在实施例1中制造复合物⑶9所用的相同。NZ蜂胶含有5. 81mg/g CAPE、20. 92mg/g短叶松素、43. 84mg/g短叶松素3乙酸酯、85. 17mg/g松属素、27. 60mg/g白 杨素以及39. 74mg/g高良姜素。巴西蜂胶含有8. 36mg/g阿特匹林c、0. 26mg/g咖啡酸以及 4. 31mg/g对香豆酸。
[0397] 结果
[0398] 对于所测试的化合物和蜂胶酊剂样品的KYSE-30细胞增殖试验的结果示于表14 中，连同三种浓度的阳性对照5-氟尿嘧啶（5-FU)，和阴性对照（仅细胞与培养基并且没有 测试化合物或阳性对照）的结果一起。在表中，η是重复测定的数目；0D是在570nm下测量 的光密度；SEM是与所测量的平均光密度值相关的标准误差；p是测量经由司徒登t检验是 统计上显著的概率值，此处被视为〈0. 05 (NS =不显著）；抑制％是与阴性对照相比增殖的 减少百分比，其中大数字指示测试化合物具有抗癌增殖潜力。
[0399] 表14.环糊精包封的蜂胶CD8和CD9以及蜂胶干固体对食管鳞状细胞癌细胞系 KYSE-30的抗增殖活性
[0401] 讨论
[0402] 这个实施例显示，尽管仅含有约1/4的蜂胶干固体，但γ -环糊精包封的NZ蜂胶 比亲本ΝΖ蜂胶干固体（增殖抑制29. 7% )更具活性（增殖抑制3L 2% )。在最高测试浓度 下活性类似于已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶（5-FU)。结果极其类似于在实施例2中由γ-环 糊精包封的ΝΖ蜂胶和ΝΖ蜂胶干固体对结肠癌细胞系DLD-1的增殖的抑制所发现的结果。 单独的γ环糊精使增殖抑制8. 8%。
[0403] 这些数据支持了本发明组合物与蜂胶相比对于抗胃肠癌的增强功效。在不希望 受任何理论约束的情况下，本申请者提出这可能归因于由ΝΖ蜂胶和环糊精组合物展现的 对胃肠癌细胞增殖的意想不到的协同作用。相比之下，巴西绿γ-环糊精蜂胶复合物具有 与等效量的巴西绿蜂胶干固体大约相同水平的活性，并且对人类食管鳞状细胞癌细胞系 KYSE-30的增殖的活性仅稍高于γ环糊精本身。这些数据还显示，对于这种细胞系，欧洲型 蜂胶是用于被环糊精包封的蜂胶的优选类型。
[0404] 工业适用性
[0405] 含有蜂胶或其提取物或级分和环糊精的本发明的抗胃肠癌组合物可以用于包括 食品和饮料、医疗装置、医疗用品、功能食品以及医药品的消费品中。使用这类组合物，例如 治疗胃肠癌和其症状的方法在医学领域中具有应用。
【主权项】
1. 一种治疗或预防受试者中的胃肠癌或者诱导受试者中的一种或多种赘生性胃肠细 胞的凋亡的方法，所述方法包括将有效量的包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组 成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物施用于有需要的受试者。2. -种在受试者中抑制胃肠肿瘤形成、抑制胃肠肿瘤生长、抑制胃肠肿瘤转移或者治 疗或预防胃肠癌的方法，所述方法包括将有效量的包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环 糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物独立、同时或依序施用于有需要的受试者。3. -种增加受试者对胃肠癌疗法的反应性或者增加受试者中的胃肠肿瘤对胃肠癌疗 法的敏感性的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和 环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物。4. 一种使对治疗具抗性的一种或多种胃肠癌细胞重新敏感的方法，所述方法包括将有 效量的包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物 施用于所述一种或多种癌细胞。5. -种至少部分逆转罹患胃肠癌的受试者中的赘生性细胞对胃肠癌疗法的抗性，或完 全或部分逆转负荷胃肠癌的患者对胃肠癌疗法的抗性，或使负荷胃肠癌的患者中对使用胃 肠癌疗法的治疗具抗性或者预测具抗性或变成抗性的一种或多种肿瘤重新敏感的方法，所 述方法包括向所述受试者施用包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶 和环糊精组成的组合物。6. -种改善肠道健康的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含蜂胶和环 糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物；并且特别是蜂胶和 γ-环糊精，例如欧洲蜂胶和γ-环糊精。7. 如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述组合物由蜂胶和环糊精组成。8. -种蜂胶和环糊精的用途，其用于制造供以下使用的组合物：在受试者中抑制胃肠 肿瘤形成、抑制胃肠肿瘤生长、抑制胃肠肿瘤转移或者治疗或预防胃肠癌；诱导受试者中的 一种或多种赘生性胃肠细胞的凋亡；增加受试者对胃肠癌疗法的反应性；增加受试者中的 胃肠肿瘤对胃肠癌疗法的敏感性；使受试者中对治疗具抗性的一种或多种胃肠癌细胞重新 敏感；至少部分逆转罹患胃肠癌的受试者中的赘生性细胞对胃肠癌疗法的抗性；完全或部 分逆转负荷胃肠癌的患者对胃肠癌疗法的抗性；或使负荷胃肠癌的患者中对使用胃肠癌疗 法的治疗具抗性或者预测具抗性或变成抗性的一种或多种肿瘤对使用胃肠癌疗法的治疗 重新敏感。9. 如权利要求8所述的用途，其中所述环糊精是γ-环糊精。10. 如权利要求8或9所述的用途，其中所述组合物包含至少一种额外治疗剂。11. 一种抗胃肠癌组合物，其包含蜂胶和环糊精。12. 如权利要求1至7中任一项所述的方法、如权利要求8至10中任一项所述的用 途、或如权利要求11所述的组合物，其中所述环糊精是γ-环糊精，或所述环糊精以包含 γ-环糊精的环糊精的组合存在。13. 如权利要求1至7或12中任一项所述的方法、如权利要求8至10或12中任一项 所述的用途、或如权利要求11或12所述的组合物，其中所述环糊精是化学改性的环糊精。14. 如权利要求1至7、12或13中任一项所述的方法、如权利要求8至10、12或13中 任一项所述的用途、或如权利要求11至13中任一项所述的组合物，其中所述蜂胶是蜂胶提 取物或级分。15. 如权利要求14所述的方法、用途或组合物，其中所述蜂胶不含蜡。16. 如权利要求1至7或12至14中任一项所述的方法、如权利要求8至10或12至 14中任一项所述的用途、或如权利要求11至14中任一项所述的组合物，其中所述蜂胶是欧 洲或杨树蜂胶。17. 如权利要求1至7或12至14中任一项所述的方法、如权利要求8至10或12至 14中任一项所述的用途、或如权利要求11至14中任一项所述的组合物，其中所述蜂胶是巴 西绿蜂胶。18. 如权利要求17所述的方法、用途或组合物，其中所述巴西绿蜂胶至少部分由蜜蜂 从酒神菊树（Baccharisdracanculifolia)的叶渗出物获得。19. 如权利要求1至7或12至18中任一项所述的方法、如权利要求8至10或12至 18中任一项所述的用途、或如权利要求11至18中任一项所述的组合物，其中所述组合物包 含约1.Owt%至约99wt%蜂胶。20. 如权利要求1至7或12至18中任一项所述的方法、如权利要求8至10或12至 18中任一项所述的用途、或如权利要求11至18中任一项所述的组合物，其中所述组合物包 含约1.Owt%至约99wt%蜂胶树脂。21. 如权利要求19所述的方法、用途或组合物，其中所述组合物包含约lwt%至约 99wt%蜂胶、约lwt%至约25wt%蜂胶、约lwt%至约30wt%蜂胶、约5wt%至约25wt%蜂 胶、约5wt%至约30wt%蜂胶、约5wt%至约99wt%蜂胶、约10wt%至约25wt%蜂胶、约 10wt%至约30wt%蜂胶、约10wt%至约99wt%蜂胶、约15wt%至约25wt%、约15wt%至约 30wt%、约 15wt% 至约 99wt%、约 20wt% 至约 25wt%、约 20wt% 至约 30wt%、约 20wt% 至 约99wt%、或约25wt%蜂胶、或约30wt%蜂胶。22. 如权利要求20所述的方法、用途或组合物，其中所述组合物包含约lwt%至约 99wt%蜂胶树脂、约lwt%至约25wt%蜂胶树脂、约lwt%至约30wt%蜂胶树脂、约5wt% 至约25wt%蜂胶树脂、约5wt%至约30wt%蜂胶树脂、约5wt%至约99wt%蜂胶树脂、约 10wt%至约25wt%蜂胶树脂、约10wt%至约30wt%蜂胶树脂、约10wt%至约99wt%蜂胶 树脂、约15wt%至约25wt%、约15wt%至约30wt%、约15wt%至约99wt%、约20wt%至约 25wt%、约20wt%至约30wt%、约20wt%至约99wt%、或约25wt%蜂胶树脂、或约30wt% 蜂胶树脂。23. 如权利要求1至7或12至22中任一项所述的方法、如权利要求8至10或12至 22中任一项所述的用途、或如权利要求11至22中任一项所述的组合物，其中所述组合物中 的所述蜂胶被完全包封于所述环糊精内。24. 如权利要求1至7或12至23中任一项所述的方法、如权利要求8至10或12至 23中任一项所述的用途、或如权利要求11至23中任一项所述的组合物，其中所述组合物中 蜂胶与环糊精的摩尔比不大于约1:1。25. -种组合物，其包含蜂胶和γ-环糊精、基本上由蜂胶和γ-环糊精组成、或由蜂胶 和γ-环糊精组成。26. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于在受试者中抑制胃肠肿瘤形成、抑 制胃肠肿瘤生长、抑制胃肠肿瘤转移或者治疗或预防胃肠癌；诱导受试者中的一种或多种 赘生性胃肠细胞的凋亡；增加受试者对胃肠癌疗法的反应性；增加受试者中的胃肠肿瘤对 胃肠癌疗法的敏感性；使受试者中对治疗具抗性的一种或多种胃肠癌细胞重新敏感；至少 部分逆转罹患胃肠癌的受试者中的赘生性细胞对胃肠癌疗法的抗性；完全或部分逆转负荷 胃肠癌的患者对胃肠癌疗法的抗性；或使负荷胃肠癌的患者中对使用胃肠癌疗法的治疗具 抗性或者预测具抗性或变成抗性的一种或多种肿瘤对使用胃肠癌疗法的治疗重新敏感。27. 如权利要求26所述的组合物，其用于治疗或预防胃肠癌。28. -种抗胃肠癌组合物，其包含环糊精。29. 如权利要求16所述的方法、用途或组合物，其中所述欧洲蜂胶具有大于约lmg/g的 咖啡酸苯基醚酯浓度。30. 如权利要求16或29所述的方法、用途或组合物，其中所述欧洲蜂胶具有大于约 10mg/g的松属素浓度。31. 如权利要求16、29或30所述的方法、用途或组合物，其中所述欧洲蜂胶具有大于约 5mg/g的高良姜素浓度。32. 如权利要求16或权利要求29至31中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述 欧洲蜂胶具有大于约3. 5mg/g的白杨素浓度。33. 如权利要求1至32中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述组合物包含咖啡 酸苯基醚酯（CAPE)、咖啡酸、松属素、咖啡酸苯甲酯、白杨素、高良姜素以及短叶松素中的两 者或更多者。34. 如权利要求1至33中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述组合物是已经添 加有CAPE、咖啡酸、松属素、咖啡酸苯甲酯、白杨素、高良姜素以及短叶松素中的一者或多者 的组合物。35. 如权利要求1至34中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述组合物具有大于 约lmg/g的CAPE浓度。36. 如权利要求1至35中任一项所述的方法、用途或组合物，其中组合物具有大于约 lmg/g的松属素浓度。37. 如权利要求1至36中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述组合物具有大于 约lmg/g的高良姜素浓度。38. 如权利要求1至37中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述组合物具有大于 约lmg/g的白杨素浓度。39. 如权利要求1至38中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述组合物具有大于 约lmg/g的短叶松素浓度。40. 如权利要求1至39中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述组合物具有大于 约lmg/g的咖啡酸浓度。
【专利摘要】本发明提供了含有蜂胶和环糊精的医药组合物，包括抗胃肠癌组合物。还提供了使用这类组合物的方法，特别是治疗或预防胃肠癌以及使胃肠癌对疗法重新敏感。
【IPC分类】A61K35/644, A61P1/00, A61K47/40, A61P35/00
【公开号】CN105307665
【申请号】CN201480030083
【发明人】D·L·拉扎洛瓦, K·保罗, O·卡奇普尔
【申请人】蜜纽康新西兰有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2014年4月7日
【公告号】CA2908185A1, EP2983681A1, US20160051594, WO2014163513A1