体的 CDR，并且其中存在的任何恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85或90%、优 选至少95%相同。因此，可能除CDR之外，人源化抗体的所有部分都与一个或多个天然人免 疫球蛋白序列的相应部分基本相同。例如，人源化的免疫球蛋白通常不包含嵌合的小鼠可 变区/人恒定区抗体。作为实例，可以如下进行人源化免疫球蛋白的设计：当氨基酸属于下 述类别时，所采用的人免疫球蛋白（受体免疫球蛋白）的框架氨基酸被源自提供CDR的非人 免疫球蛋白（供体免疫球蛋白）的框架氨基酸替换：（a)受体免疫球蛋白的人框架区中的氨 基酸对于人免疫球蛋白来说在所述位置是不常见的，而供体免疫球蛋白中的相应氨基酸对 于人免疫球蛋白来说在所述位置是常见的；（b)氨基酸的位置紧邻一个CDR;或(c)在三维免 疫球蛋白模型中，框架氨基酸的任意侧链原子在CDR氨基酸的任意原子的约5-6埃（中心-至-中心）之内（QUEEN等，Proc ? Natl ? Acad ? Sci ? USA，vol ? 88，p: 2869，1991)。当受体免疫球 蛋白的人框架区中的氨基酸和供体免疫球蛋白中的相应氨基酸的每个对于人免疫球蛋白 来说在该位置不常见时，这种氨基酸被对于人免疫球蛋白来说在该位置典型的氨基酸替 换。
[0080] 本文所用术语"抗体片段"是指能够与其抗体对应物的相同的抗原反应的抗体片 段。本领域技术人员可以简单地识别这种片段，其包括，作为实例，本发明包括F ab片段(例如 通过木瓜蛋白酶消化）、Fab'片段(例如通过胃蛋白酶消化和部分还原）、F( ab'）2片段(例如通 过胃蛋白酶消化）、Facb(例如通过纤溶酶消化）、Fd(例如，通过胃蛋白酶消化、部分还原和再 聚合）、以及scFv(单链Fv;例如通过分子生物学技术)片段。
[0081]采用本领域已知的和/或本文所述的酶裂解、合成或重组技术可以生产这种片段。 也可以采用抗体基因以各种截短的形式生产抗体，其中在所述抗体基因中的天然终止位点 的上游引入了一个或多个终止密码子。例如，可设计编码F( ab'）2重链部分的组合基因以包 括编码重链的CH1结构域和/或绞链区的DNA序列。抗体的各个部分可以通过常规技术化学 结合在一起，或者可以使用遗传工程化技术制备成连接蛋白。
[0082]优选地，所述抗体片段为scFv片段。
[0083]术语"拮抗T细胞活化的抑制中牵涉的免疫通路的抗体"是指拮抗免疫抑制受体， 如CTL-A4JD-1或抑制性KIR的抗体，或通过结合免疫抑制受体或其配体、由此通过防止信 号下调来促进免疫活化的抗体。作为免疫抑制受体拮抗剂抗体的实例，可以引用对应于 CTL-A4、PD-1 /PD-L1、PD-1 /PD-L2、抑制性KIR、CD2 76、VTCN1、BTLA/HVEM、LAG3、HAVCR2 和 AD0RA2A拮抗剂的抗体，优选ro-1 /PD-L1抗体。
[0084] 1987年发现了CTL-A4(细胞毒性淋巴细胞相关抗原，也称为CD152)(BRUNET等， Nature，vol. 328，p: 267-270,1987) XTL-A4的主要作用是抑制T细胞活化，这一作用见于患 有大量淋巴组织增生的缺乏CTL-A4的小鼠中（CHAMBERS等，Immunity，vol. 7，p: 8855-8959， 1997)。现在，已表明CTL-A4的阻滞能够增强T细胞在体夕KWALUNAS等，Immunity，vol.l，p: 405-413,1994)和体内（KEARNEY, J. Immunol，vol ? 155，p: 1032-1036,1995)的响应，并且还 能增加抗肿瘤免疫(LEACH, Science，vol. 271，p: 1734-1736,1996)。作为对应于 CTL-A4 拮抗 剂的抗体的实例，可以引用公开在W0 01/14424中的易普利单抗（ipi 1 imumab)(也称为MDX-010和 10D1，可从MEDAREX获得，且由 BRISTOL-MYERS SQUIBB公司以YERV0Y?出售）；公开在WO 00/37504中的ticilimumab(也称为11.2.1和CP-675,206);和公开在国际专利申请TO 98/ 42752、W0 01/14424、W0 2004/035607和W0 2012/120125中的，公开在EP 1212422和EP 1262193中的，公开在美国专利Nos.US 5,811，097、US 5,855,887、US 5,977,318、US 6， 051，227、US 6,207，156、US 6,682,736、US 6,984,720、US 7，109,003和US 7，132,281 中的 CTL-A4抗体，它们以引用的方式并入本文。
[0085] 程序性细胞死亡1，也称为PD-1(还称为PD⑶1或⑶279)，是~55kDI型膜糖蛋白。 PD-1是⑶28共刺激基因家族的受体，其在天然T、B和NK细胞上适度表达，并通过T/B细胞受 体信号传导在淋巴细胞、单核细胞和髓细胞上上调。PD-1具有两个已知的表达谱不同的配 体:PD-L1(B7-H1)，其在天然淋巴细胞、在活化的B细胞和T细胞、单核细胞和树突细胞上广 泛表达;和TO-L2(B7-DC)，其表达被限制在活化的树突细胞、巨噬细胞和单核细胞及血管内 皮细胞上。在一些鼠的同源肿瘤模型中，PD-1或PD-L1的阻滞显著地抑制肿瘤生长或诱导完 全消退。因此，PD-1被认为是免疫调节和外周耐受维持中的重要参与物质。作为对应于PD-1/PD-L1/PD-L2拮抗剂的抗体的实例，可以引用公开在W02006/121168中的纳武单抗 (nivolumab)(也称为BMS-936558或MDX1106;抗-PD-1 抗体，BRISTOL-MYERS SQUIBB);公开 在TO2009/114335中的Merck 3745(也称为MK-3475或SCH-900475,为抗-PD-1 抗体）；公开在 W02009/101611 中的CT-01 1(也称为hBAT或hBAT-1，抗-PD-1抗体）；公开在W02008/156712 中的lambrolizumab;公开在W02010/027423、W02010/027827、W02010/027828和W02010/ 098788中的AMP514;以及公开在国际专利申请W02004/056875、W02006/056875、W02008/ 083174、TO2010/029434、TO2010/029435、TO2010/036959、TO2010/089411、W02011/110604、 TO2012/135408和W02012/145493中的抗体。所述ro-1拮抗剂可对应于抗-PD-L1抗体，如公 开在 W02007/005874 中的 MDX-1 105(也称为 BMS-936559,抗-PD-L1 抗体）或公开在 W02010/ 077634中的YW243.55. S70(也称为MPDL3280A或RG7446;抗-PD-L1抗体），它们以引用的方式 并入本文。
[0086] 杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是在免疫系统的重要细胞一一天然杀伤(NK)细 胞上发现的细胞表面蛋白家族。这些杀伤细胞免疫球蛋白样受体通过与在所有细胞类型上 表达的MHC I类分子相互作用来调节天然杀伤细胞的杀伤功能。上述相互作用使它们能够 检测在其表面具有特征性低水平的I类MHC的病毒感染细胞或肿瘤细胞。多数KIR为抑制性 的，即KIR对MHC的识别抑制其NK细胞的细胞毒性活性。仅有限数量的KIR具有活化细胞的能 力。
[0087] 抑制性KIR具有含有免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM)的长细胞质尾，该长细胞 质尾通过其MHC I类配体的接合将抑制性信号转导至NK细胞。已知的抑制性KIR包括包含 KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2和KIR3DL3的 KIR2DL和KIR3DL亚家族的成员。作为对应于抑制性KIR拮抗剂的抗体的实例，可以引用公开 在W02006/003179中的抗体1-7F9,其以引用的方式并入本文。
[0088]通过免疫细胞、最近通过肿瘤细胞而已知B7配体家族成员具有强的免疫调节活 性，这一家族包括⑶276和VTCN1。
[0089] CD276 (分化抗原簇 276)(也称为 B7H3、B7-H3、B7RP-2、4Ig-B7-H3)是源自 B7 配体家 族的I型跨膜蛋白，其首次于树突细胞和活化的T细胞中得到鉴定。CD276由一些实体肿瘤表 达并认为其参与T细胞介导的免疫响应的调节。更特别地，CD276似乎下调T辅助细胞免疫响 应并抑制免疫(SUH等，2003)。作为CD276拮抗剂的实例，可以引用公开在专利申请US 2005/ 0169932和W0 2008/116219中的抗体8H9,和其它抗体如公开在W0 2011/109400中的 MGA271〇
[0090] VTCN1 (含有v-set结构域的T细胞活化抑制剂1)，也称为B7X、B7H4、B7S1、B7-H4，& 是B7家族的成员。VTCN1被认为在T细胞响应的抑制性调节中发挥重要作用，并且研究表明 这种蛋白的高水平与肿瘤进展有关。作为VTCN1拮抗剂的实例，可以引用公开在W0 2009/ 073533中的抗体。
[0091] BTLA(B-和T-淋巴细胞衰减因子），也称为⑶272,其在T细胞活化过程中被诱导并 保持在Thl细胞、而非Th2细胞上表达。BTLA通过与肿瘤坏死因子（受体），成员14 (丁陬1??14)，也称为单纯疱疹病毒侵入介质（见^]\〇、11?2、4141?、见^\丄0270、116取'1?的相互 作用来显示T-细胞抑制作用。TNFRSF14被认为是单纯疱疹病毒(HSV)侵入的细胞介质。已发 现该受体的胞质区结合至几种可介导活化免疫响应的信号转导通路的TRAF家族成员。最 后，BTLA/HVEM复合物负调节T细胞免疫响应。作为BTLA/HVEM拮抗剂的实例，可引用公开在 W02008/076560、W02010/106051 和W0 2011/014438中的抗体。
[0092] LAG3(淋巴细胞活化基因3，也称为⑶223)属于免疫球蛋白（Ig)超家族，其含有4个 胞外Ig样结构域。作为LAG3拮抗剂的实例，可以引用公开在W02010/019570中的抗体。
[0093] HAVCR2 (甲型肝炎病毒细胞受体2，也称为Tim-3、IQM-3、HMD3、Tim-3和HMD-3)是 属于免疫球蛋白超家族的Th-1特异性细胞表面蛋白。HAVCR2调节巨噬细胞的活化并抑制 Th-1介导的自体免疫响应和同种免疫响应，从而促进免疫耐受。作为HAVCR2拮抗剂的实例， 可以引用公开在W02013/006490A中的抗体。
[0094] AD0RA2A(腺苷A2a受体，也称为A2aR、RDC8或AD0RA2)属于鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G 蛋白）偶联受体(GPCR)超家族，该家族细分为类和亚型。这种蛋白在许多生物功能（如心脏 节律和血液循环、脑和肾血流动、免疫功能、疼痛调节和睡眠）中都发挥重要作用。AD0RA2A 涉及病理生理状况，如炎性疾病和神经退行性疾病。
[0095] 所述抗体或其片段与所述缀合物未连接。
[0096] 核酸和载体
[0097] 本文所用术语"多核苷酸"是指RNA或DNA，优选DNA。
[0098] 优选地，这种"多核苷酸"可操作地连接到基因表达序列，所述基因表达序列引导 核酸在原核细胞或真核细胞内，优选真核细胞内的表达。"基因表达序列"为任何调控核苷 酸序列，例如启动子序列或启动子_增强子组合，基因表达序列促进其可操作地连接的免疫 细胞因子核酸的有效转录和翻译。基因表达序列可以例如为哺乳动物启动子或病毒启动 子，例如组成型或诱导型启动子。
[0099] 组成型哺乳动物启动子包括但不限于用于如下基因的启动子:次黄嘌呤磷酸核糖 转移酶(HPTR)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、肌动蛋白启动子、肌肉肌酸激酶启动子、人延伸 因子启动子及其它组成型启动子。在真核细胞中组成性起作用的示例性病毒启动子包括， 例如源自猴病毒(例如SV40)、乳头状瘤病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒 (CMV)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)、乙型肝炎病毒(HBV)、莫洛尼氏白血病病毒的长末端重复序 列(LTR)及其它逆转录病毒的启动子，和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。其它组成型启动 子是本领域普通技术人员已知的。
[0100] 可用作基因表达序