专利名称：从茶叶加工下脚料中制备高纯度单体儿茶素的方法
技术领域：
本发明涉及植物提取物，特别是茶叶提取物，具体是从茶叶加工下脚料中制备高纯度单体儿茶素的方法。
背景技术：
茶叶作为中华民族的传统保健饮料已有四五千年的历史。我国是茶叶生产大国，茶叶资源非常丰富，年产成品茶约60万吨。开发茶叶的新用途，开展茶叶的综合利用，尤其是利用低档茶叶或茶叶加工的下脚料来生产高附加值的精细化学品，是ー个具有重要意义的研究课题。60年代初，日本科学家发现茶叶提取物中含有一种抗氧化活性成分，各国科学家相继深入研究，证明它是ー类 多酚化合物，即茶多酚(TP)。茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称。为白色无定形粉末，易溶于水，可溶于こ醇、甲醇、丙酮、こ酸こ酷，不溶于氯仿。緑茶中茶多酚的含量较高，占其质量的15% 30%。茶多酚类物质大致可分为6种黄烷醇类，4-羟基黄烷醇类，花色苷类，黄酮类，黄酮醇类和酚酸类。其中以黄烷醇类(主要是儿茶素类化合物)最为重要，占茶多酚总量的60% 80%。其次是黄酮类，其它酚类物质含量比较少。茶多酚于1996年列入GB2760-1996食品添加剂国家标准，用作抗氧化剂，1997年列为中成药原料。茶多酚已成为医药、食品界开发的热点，目前除了茶多酚片剂、胶囊剂等夕卜，作为抗氧化剂和食品添加剂在粮油食品、方便食品、水广品、肉制品、调味品、糖果、饮料等多类食品中均有广泛的应用，有强劲的市场需求，开发和应用前景十分广阔。实际上，在茶多酚的有效组成份中以黄烷醇类为主，黄烷醇类又以儿茶素类物质为主。儿茶素类物质的含量约占茶多酚总量的70%左右。儿茶素类化合物是茶多酚的主要成分，其结构式可表示为
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儿茶素没食子酸酷(L-ECG) ^1=H, R2=H,则为左旅-表儿茶素(L-EC)。儿茶素类化合物的基本结构均为2-连(或邻)苯酚基苯并吡喃衍生物，正是这种结构中具有连或邻苯酚基，作为抗氧化剂的活性就高于一般非酚类或单酚羟基类抗氧化剂。其等摩尔浓度的抗氧化能力依次为L-EGCG > L-EGC > L-ECG > L-EC0从茶叶中提取的茶多酚抗氧化剂是这些儿茶素的混合物。其抗氧化性优于丁基羟基茴香醚(BHA)、ニ丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基对苯ニ酚(TBHQ)等。国内外学者进行了急性毒性、亚急性毒性和各种药理实验研究，结果表明这些儿茶素安全无毒。儿茶素是茶叶中的重要组分，已广泛应用于食品加工，医药保健与日用化工等领域，其中儿茶素単体表没食子儿茶素没食子酸酷(EGCG)的药理活性最強，更加引起人们的关注。儿茶素的主要生理活性表现在抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗癌抗突变、以及用于心血管疾病和对免疫系统的调节作用。酯型儿茶素(EGCG)，其还原性甚至可达L-VC之100倍。在医学方面可防治心血管疾病、可抗癌抗突变、可治疗皮炎、有降血糖、降血压、抗病毒等多种作用。在酶工程方面能通过氢键与蛋白质和酶结合形成沉淀，分离出酶和蛋白质，以保证食品医药用酶的安全卫生和特殊要求。 目前，儿茶素已经成为脱离茶多酚的ー种独立产品，在医药方面取得了令人瞩目的进展，其严格的质量要求、先进的技术、昂贵的售价和诱人的利润正引起全球的优秀科学家和工程师的极大兴趣。干绿茶叶中茶多酚的含量约20%，低档茶，茶梗，茶末等下脚料以及杀青叶、秋季剪枝叶中均可含10%左右的茶多酚，充分而有效地利用这ー资源优势，深度开发优质和高附加值的茶多酚产品，其经济效益是十分显著的。应用和开发领域十分广阔。茶多酚的提取和应用受到国内外的广泛关注，开拓了茶叶化学研究的新领域，发展以农副产物为原料的精细化学品，开发“緑色技木”，发展“緑色工程”已成为热门课题。到目前为止，茶多酚的提取エ艺和儿茶素的分离纯化在国内外都有有较多的报道，但我国的研究较多，报道也较系统全面。有代表性的，也是水平较高的是由中国家业科学院茶叶研究所、西南农业大学、华中农业大学共同承担的农业部八五重点科研项目"茶叶有效成分提出取及加工技术研究"，1996年通过农业部成果鉴定，专家认定达到国际领先水平。鉴定结果为①得率高，95%的茶多酚提取率可达3.5%，而一般エ艺仅I. 5% 级品质好，活性高，有机溶剂残留低。具有生理活性儿茶素含量在60%以上，而一般エ艺仅为30%。而由福建物质结构研究所开发成功的高纯度茶多酚的提取エ艺技术及有效成分的分离技木，95%的茶多酚提取率可达8. 0%以上，具有生理活性儿茶素含量在65%以上。刘军海等的“复合酶法提取茶多酚エ艺条件研究”以低档绿茶为原料，采用复合酶法在较低温度下提取茶多酚。以单因素试验考察了酶用量、提取温度、提取时间及pH对茶多酚提取率的影响。通过正交试验优化并确定最佳提取エ艺条件酶用量为O. 20%、提取温度为60°C、提取时间80min、pH为4. 6。结果表明，在此エ艺下，茶多酚提取率为13.6%，其中儿茶素占荼叶干重的含量比沸水提取法最大可高出2. 31%。钟世安等“大孔吸附树脂对酯型儿茶素吸附性能的研究”系统研究了 AB-8，PA，HPD600，NKA-9，NKA-II等5种大孔吸附树脂对EGCG的吸附性能。结果表明，这5种大孔吸附树脂对EGCG的吸附效率随AB-8，PA，HPD600, NKA-9, NKA-II的顺序依次减小.选择大孔吸附树脂PA为吸附剂，用PA时EGCG、ECG、GCG进行静态和动态吸附实验“及解吸剂的选择实验，研究了吸附速率曲线，确定了最佳吸附流速，根据解吸效果和绿色提取的需要，决定选用无毒有机溶剂C作为解脱剂。在专利文 献方面，已有技术也有很多
CN1367171儿茶素中EGCg有效含量达90%以上，可直接用于药物原料。
CN1379027产品纯度可达90%以上，其副产品为茶多酚和咖啡碱。本发明已成功通过エ业化生产试验。
CN1683363所选用的溶剂价廉、毒性小、易于回收、无残留，所得样品纯度高达到95%以上，成本低、时间短、操作简单。CN102304115A提供茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法，需加入液氮。CN101182319用こ酰化试剂使茶多酚中的多酚物质羟基こ酰化，然后用硅胶柱色谱分离得到全こ酰化的表没食子儿茶素没食子酸酷，再使全こ酰化的表没食子儿茶素没食子酸酯在酸性条件下和质子性溶剂中水解得到表没食子儿茶素没食子酸酷。CN101381359通过咖啡因沉淀、液相萃取和闪烁硅胶柱色谱技术联用纯化。上述方法都有不足之处，有的收得率理想，有的分离效果不好，有的成本高，有的要使用特别的物料。另外这些研究普遍的只是注与众不同的创新，而不能形成一套完整的ェ艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种从茶叶加工下脚料中制备高纯度单体儿茶素的方法。本发明的方法包括提取茶多酚、分离出儿茶素并进行纯化，其エ艺过程包含
A.原料粉碎；
B.加水在酸性条件下加入由纤维素酶、蛋白酶和果胶酶组成的复合酶进行酶解；
C.酶解液用こ酸こ酯萃取，萃取液浓缩和/或干燥，得茶多酚粗品；
D.将浓缩或/和干燥物加水成液体，调节PH5.6 6. 5，加入CaCl2和ZnCl2混合沉淀
剂；
E.滤出的沉淀物以稀盐酸溶解后直接经大孔树脂吸附，水洗后，再こ醇洗脱，浓缩こ醇洗脱液和/或干燥，得茶多酚精品；然后，
F.加水成液体，用大孔树脂吸附，水洗后再用こ醇水溶液洗脱，分别收集含EGCG，GCG,ECG纯度为98%以上的洗脱液；然后，
G.加水使各洗脱液的こ醇浓度为I 10%;然后，
H.再分别用与F同型号的大孔树脂吸附，用90 99.5%こ醇洗脱，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥得成品。本发明的方法的原料取自新鲜茶叶、剪枝茶叶、非发酵过的茶叶加工下脚料。为了更好地提取有效成分，原料需要粉碎至20 80目。上述，在Bエ序，加水量为茶叶干重的10 20倍，PH=3 6. 5，复合酶组成比例为纤维素酶蛋白酶果胶酶=0. I 5 :0. I 5 :0. I 5，复合酶用量为茶叶干重的O. I 1%，温度40 65で。在Dエ序加水量为粗品干重的10 20倍，CaCl2和ZnCl2混合沉淀剂的混合比例=1 0. 01 99，Ca2+和Zn2+的量和与溶液中茶多酚的量=0. 01 O. 05 (mol/g)。在Eエ序稀盐酸的浓度为O. 1% 10%，水洗的水用量为大孔树脂体积的I 5倍，乙醇浓度为90% 99. 5%。在F工序加水量为精品干重的2 5倍，水洗的水为去离子水，其用量为大孔树脂体积的I 5倍，之后乙醇水溶液洗脱的程序为用I 3倍树脂体积量的10%乙醇水溶液洗脱——用I 3倍树脂体积量的20%乙醇水溶液洗脱——用I 3倍树脂体积量的30%乙醇水溶液洗脱——用I 3倍树脂体积量的90% 99. 5%乙醇洗柱。本发明中，大孔树脂选自非极性大孔吸附树脂、弱极性大孔吸附树脂和氢键型大孔吸附树脂。优选 D101、AB-8、DMl30、HPD826、ADS-17。在实际过程中，B工序的酶解需要搅拌提取三次，每次搅拌3(T90min，过滤，合并滤液经乙酸乙酯萃取后真空浓缩、干燥。 在D工序,加入混合沉淀剂也需要搅拌30min"90min,以促使反应完全。本发明采用酶辅助浸提是一种绿色、安全、环保的生产工艺，蛋白酶、果胶酶、纤维素酶的复合酶在低温条件下分解构成细胞壁及细胞间质的纤维素和果胶质以及植物蛋白。复合酶法提取茶多酚，茶多酚的提取率为If 15%，已经达到有机溶剂法的效果。其有效成分儿茶素的提取率可达8. 0%以上。酶法提取的反应条件比较温和，避免了有效成分的高温氧化，从而提高了儿茶素的提取率。沸水提取是在高温下进行，高温水提导致部分热稳定性较差的儿茶素氧化失活；酶法提取的最大优势在于提取过程温度低，从而最大限度地减少了茶多酚提取过程中活性成份儿茶素的损失。TP粗品含有多种多酚类物质，就是儿茶素，这是茶多酚的有效成分，但是也含有杂质。金属离子沉淀法利用酚类物质能与某些金属离子络合生成沉淀物特点，使其在与其它物质分离而出，从而得到纯度较高的茶多酚。目前常用金属离子用Zn、Al、Fe、Mg、Ba、Ca等离子，研究发现使用复合金属离子更加有利于茶多酚的纯化。我们选用ZnCl2、CaCl2作复合沉淀剂，在pH值为5. 6 6. 5的条件下，使儿茶素以金属盐的形式沉淀，沉淀物经去离子水洗涤后，用稀盐酸溶解，将溶解液直接上大孔树脂柱，去离子水洗去无机离子后再用乙醇洗脱，洗脱液浓缩、干燥(实际生产中浓缩后直接转下道工序)。得到纯度高于98%的高纯度茶多酚，儿茶素的总含量达到65%以上，其中EGCG的含量大于55%。较现有方法在茶多酚纯度、EGCG含量等技术指标方面有较大的提高。该方法使用锌离子和钙离子，并采用大孔树脂这一普遍应有于食品药品行业的新型材料，选择性和提取率较高，产品纯度高，对人体无毒害，同时，Zn2+和Ca2+还具有多种生理保健功能，因而安全性和实用性较强。该方法还减少了有机溶剂的使用量，有利于安全生产和环境保护。同时，沉淀法所需设备少，工艺规程简单，成本低。TP精品中，存在混合的天然酯型儿茶素。目前，茶叶中已发现含量较高的儿茶素主要有7种EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)、ECG (表儿茶素没食子酸酯)、GCG (没食子儿荼素没食子酸酯)、EGC (表没食子儿茶素)、GC(没食子儿茶素)、EC (表儿茶素)、C (儿茶素)。在药学上现己确定茶多酚中的主要成分酯型儿茶素有EGCG、ECG、GCG，而其中EGCG的含量最多，且它是极具抗癌的有效成分。在实际应用上，特别是在高端需求方面，各种儿茶素需要以单体的形式加入使用，所以还需要对TP精品进一步处理，获得各种单体儿茶素。我们首先采用大孔树脂柱层析进行一次分离的方法(F工序)，洗脱剂使用乙醇-水。在除去杂质的同时，将各种儿茶素单独分离开来，得到了高浓度的酯型儿茶素单体流份液。然后进行大孔树脂柱层析进行二次纯化(H工序)。将一次分离得到的儿茶素单体流份液再用大孔树脂吸附，用高浓度的乙醇洗脱，得到纯度大于99%的儿茶素单体乙醇液。之后浓缩，最后冷冻干燥，得到类白色的EGCG单体，检测纯度大于99%。我们选用一种新型的大孔树脂——氢键吸附大孔树脂。利用其氢键对酚类物质的选择性强吸附，可以很好地分离各种成分，是分离酚类、黄酮类多成分混合物的新秀。大孔树脂吸附吸附法具有成本低、效率高、稳定性好、容易再生等优点。国内企业将EGCG含量80%的多酚生产出含量大于98%的单体，得率约为30%，我们以TP精品(EGCG的含量大于50%)为原料，产出纯度在99. 5%以上、含量大于98%的单体，得率接近50%。对茶多酚的检测，本发明执行GB/T8313-2008。对儿茶素的检测，本发明采用HPLC，色谱条件为
色谱柱(Column) Extend. C18 (4. 6x250mm, 5um)
流速(Flow Rate) :1. Oml / min
V 柱温(Temperature):室温
检测波长(Peak Detect Wavelength) 280nm
进样体积(Injection Volume) 10ul
流动相(Mobile Phase):甲醇水:乙酸=25 :74. 5 :0. 5
使用对照品绘制标准曲线，进样，记录峰面积，计算含量。本发明的方法的优点在于
I、粗产品的生产，即从茶叶中提取茶多酚，采用复合酶水法，条件比较温和，避免了有效成分的高温氧化，从而提高了儿茶素的提取率。2、粗产品的生产过程中，我们只用一次萃取，即用乙酸乙酯萃取，而不使用氯仿(起到脱除咖啡因的作用)，消除氯仿残留确保产品安全。3、在TP精品的生产中，选用ZnCl2XaCl2作复合沉淀剂，可以比使用单一金属离子更好地分离纯化茶多酚中的各种酚类儿茶素。而且锌和钙还是对人体有生理保健的，是人体不可或缺的微量元素，即使在产品中有所存在也只是有益而无害。4、采用复合沉淀法的另外一个优点在于，可以很好地除去咖啡因。用这样的方法，和前面的粗制工艺相结合，既可以除去咖啡因，又避开具有毒性的氯仿，是互相衔接扬长避短的一套完整的优化技术。5、在精制和纯化高纯度单体的过程中，都采用大孔树脂特别是氢键吸附大孔树月旨，作为一种有独特性能、选择性很强的新材料，选择性和提取率较高，产品纯度高，对人体
无毒害。6、本项目只使用乙醇这一常用的溶剂，安全无毒价格低。 7、从粗制开始，直到制成高纯度单体儿茶素，过程中并不需要干燥，而是步步衔接顺利流转，形成一套完整的合理的工艺
粗品-沉淀-直接上大孔树脂柱-乙醇洗脱液浓缩-上大孔树脂-乙醇液-浓缩-冷冻干燥-产品。——这样的工艺既能减少儿茶素在加工过程中的氧化，也使得生产过程简单，提高得率和产量。8、整个生产中使用一种大孔树脂和一种溶剂，给生产管理和物料采购及管理带来便利。9、本工艺技术所得产品质量和产品得率，均比现有技术要高。
图I是本发明的工艺流程图。图2是茶多酚粗品HPLC检测图谱。图3是茶多酚精品HPLC检测图谱。
图4是EGCG单体HPLC检测图谱。
具体实施例方式(一)粗产品的制备 实施例I
干茶叶下脚料(绿茶，而非红茶)，100g，粉碎成50目，加入2000ml水，加温至60°C浸泡，调节PH=6，加入由纤维素酶、蛋白酶和果胶酶组成的混合酶(比例I :1 :1)，复合酶用量为茶叶干重的O. 5%，搅拌60min，过滤，重复提取3次，合并滤液经乙酸乙酯萃取后真空浓缩、干燥。得到含量18. 1%的茶多酚21. 8g。按干茶叶含茶多酚30%、含儿茶素22%计，茶多酚的提取率为13. 2%。其中儿茶素的含量8. 1%，计算可以知道提取率8%。实施例2
鲜茶叶60°C烘干，取干重100g，粉碎成20目，加入IOOOml水，加温至40°C浸泡，调节PH=3，加入由纤维素酶、蛋白酶和果胶酶组成的混合酶(比例5 :0. I :5)，复合酶用量为茶叶干重的O. 1%，搅拌90min，过滤，重复提取3次，合并滤液经乙酸乙酯萃取后真空浓缩、干燥。得到含量17. 5%的茶多酚34. 6g。按烘干茶叶含茶多酚36%、含儿茶素28%计，茶多酚的提取率为16. 8%。其中儿茶素的含量7. 6%，计算可以知道提取率9. 4%。实施例3
与实施例I相同的干茶叶100g，粉碎成80目，加入1500ml水，加温至50°C浸泡，调节PH=6. 5，加入由纤维素酶、蛋白酶和果胶酶组成的混合酶(比例0. I 5 :5)，复合酶用量为茶叶干重的1%，搅拌30min，过滤，重复提取3次，合并滤液经乙酸乙酯萃取后真空浓缩、干燥。得到含量16. 9%的茶多酚26. 5g，茶多酚的提取率为14. 9%。其中儿茶素的含量6. 97%，计算可以知道提取率8. 4%。实施例4
与实施例I相同的干茶叶100g，粉碎成60目，加入1800ml水，加温至55°C浸泡，调节PH=5. 5，加入由纤维素酶、蛋白酶和果胶酶组成的混合酶(比例5 5 :0. 1)，复合酶用量为茶叶干重的0. 25%，搅拌60min，过滤，重复提取3次，合并滤液经乙酸乙酯萃取后真空浓缩、干燥。得到含量18. 7%的茶多酚25. 0g，茶多酚的提取率为15. 6%。其中儿茶素的含量8. 7%，计算可以知道提取率9. 9%。(二)TP精品的制备 实施例I茶多酚粗品10g，200ml水溶解，加入CaCl2和ZnCl2混合沉淀剂(混合比例I :l)，Ca2+和Zn2+的量总和为O. 5mol,调节PH=6，搅拌60min，沉淀物过滤、水洗涤，以O. 1%的稀盐酸溶解后直接经AB-8型大孔树脂吸附(大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍)，用I倍量(I/kg)树脂体积的水流洗，然后95%乙醇洗脱，收集有效洗脱液，在60°C真空浓缩、干燥。得到纯度为99. 1%的高纯度茶多酚I. 05g，儿茶素的含量为64. 3%，其中EGCG含量为57. 86%。按粗品含茶多酚15%、含儿茶素9%计，茶多酚收得率为69. 4%，儿茶素的收得率为75. 1%。实施例2
茶多酚粗品10g，IOOml水溶解，加入CaCl2和ZnCl2混合沉淀剂(混合比例I :99)，Ca2+和Zn2+的量总和为O. Imol,调节PH=5. 6，搅拌60min，沉淀物过滤、水洗涤，以10%的稀盐酸溶解后直接经AB-8型大孔树脂吸附(大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍)，用5倍量(Ι/kg)树脂体积的水流洗，然后90%乙醇洗脱，收集有效洗脱液，在60°C真空浓缩、干燥。得到纯度为98. 9%的高纯度茶多酚I. 06g，儿茶素的含量为63. 3%，其中EGCG含量为57. 0%。按粗品含茶多酚15%、含儿茶素9%计，茶多酚收得率为69. 9%，儿茶素的收得率为74. 6%。实施例3
茶多酚粗品10g，150ml水溶解，加入CaClJP 2冗12混合沉淀剂(混合比例I :0. 01), Ca2+和Zn2+的量总和为O. 3mol,调节PH=6. 5，搅拌60min，沉淀物过滤、水洗涤，以1%的稀盐酸溶解后直接经DlOl型大孔树脂吸附(大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍)，用3倍量(Ι/kg)树脂体积的水流洗，然后99. 5%乙醇洗脱，收集有效洗脱液，在60°C真空浓缩、干燥。得到纯度为99. 7%的高纯度茶多酚I. 08g,儿茶素的含量为63. 25%，其中EGCG含量为56. 93%。按粗品含茶多酚15%、含儿茶素9%计，茶多酚收得率为71. 8%，儿茶素的收得率为75. 9%。(三)儿茶素单体的制备 实施例I
TP精品IOgJa 50ml的去离子水溶解，用AB-8型大孔树脂柱吸附，大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍，然后向柱中加入IOOml (为大孔树脂体积的I倍量)去离子水，待水从柱下端流完，将IOOml的10%乙醇水溶液从柱顶端往下流洗，接着用IOOml的20%乙醇水溶液、IOOml的30%乙醇水溶液、IOOml的90%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG纯度为98%以上的洗脱液，往洗脱液中加水使乙醇浓度降至10%，再经同型号的大孔树脂吸附(大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍)，用90%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，得到类白色的EGCG单体重量为3. 02g，检测纯度为99. 5%，含量为98. 6%，按TP精品中EGCG含量58%计算，收得率为51. 3%。实施例2
TP精品IOgJa 20ml的去离子水溶解，用AB-8型大孔树脂柱吸附，大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍，然后向柱中加入500ml (为大孔树脂体积的5倍量)去离子水，待水从柱下端流完，将300ml的10%乙醇水溶液从柱顶端往下流洗，接着用300ml的20%乙醇水溶液、300ml的30%乙醇水溶液、300ml的99. 5%乙醇水溶液依次流洗，收集纯度为98%以上的洗脱液，往洗脱液中加水使乙醇浓度降至5%，经同型号的大孔树脂吸附(大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍)，用99. 5%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，得到类白色 的EGCG单体重量为3. 06g,检测纯度为99. 2%，含量为98. 1%，按TP精品中EGCG含量58%计算，收得率为51.8%。实施例3
TP精品IOgJa 30ml的去离子水溶解，用AB-8型大孔树脂柱吸附，大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍，然后向柱中加入300ml (为大孔树脂体积的3倍量)去离子水，待水从柱下端流完，将200ml的10%乙醇水溶液从柱顶端往下流洗，接着用200ml的20%乙醇水溶液、200ml的30%乙醇水 溶液、200ml的95%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG纯度为98%以上的洗脱液，往洗脱液中加水使乙醇浓度降至1%，再经同型号的大孔树脂吸附(大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍)，用95%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，得到类白色的EGCG单体重量为3. 03g,测纯度为99. 2%，EGCG含量为98. 8%，按TP精品中EGCG含量58%计算，收得率为51. 6%。实施例4
TP精品10g，加30ml的去离子水溶解，用DlOl型大孔树脂柱吸附，大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍，然后向柱中加入300ml (为大孔树脂体积的3倍量)去离子水，待水从柱下端流完，将200ml的10%乙醇水溶液从柱顶端往下流洗，接着用200ml的20%乙醇水溶液、200ml的30%乙醇水溶液、200ml的95%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG纯度为98%以上的洗脱液，往洗脱液中加水使乙醇浓度降至5%，再经同型号的大孔树脂吸附(大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍)，用95%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，得到类白色的EGCG单体重量为3. 07g，检测纯度为99. 2%，EGCG含量为99. 0%，按TP精品中EGCG含量58%计算，收得率为52. 4%。实施例5
TP精品10g，加30ml的去离子水溶解，用DM130型大孔树脂柱吸附，大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍，然后向柱中加入300ml (为大孔树脂体积的3倍量)去离子水，待水从柱下端流完，将200ml的10%乙醇水溶液从柱顶端往下流洗，接着用200ml的20%乙醇水溶液、200ml的30%乙醇水溶液、200ml的95%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG纯度为98%以上的洗脱液，往洗脱液中加水使乙醇浓度降至5%，再经同型号的大孔树脂吸附(大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍)，用95%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，得到类白色的EGCG单体重量为3. Og,检测纯度为99. 1%，EGCG含量为98. 8%，按TP精品中EGCG含量58%计算，收得率为51. 1%。实施例6
TP精品IOgJp 30ml的去离子水溶解，用HPD826型大孔树脂柱吸附，大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍，然后向柱中加入300ml (为大孔树脂体积的3倍量)去离子水，待水从柱下端流完，将200ml的10%乙醇水溶液从柱顶端往下流洗，接着用200ml的20%乙醇水溶液、200ml的30%乙醇水溶液、200ml的95%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG纯度为98%以上的洗脱液，往洗脱液中加水使乙醇浓度降至5%，再经同型号的大孔树脂吸附(大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍)，用95%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，得到类白色的EGCG单体重量为3. 04g，检测纯度为99. 7%，含量为99. 3%，按TP精品中EGCG含量58%计算，收得率为52. 0%。实施例7
TP精品IOgJp 30ml的去离子水溶解，用ADS-17型大孔树脂柱吸附，大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍，然后向柱中加入300ml (为大孔树脂体积的3倍量)去离子水，待水从柱下端流完，将200ml的10%乙醇水溶液从柱顶端往下流洗，接着用200ml的20%乙醇水溶液、200ml的30%乙醇水溶液、200ml的95%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG纯度为98%以上的洗脱液，往洗脱液中加水使乙醇浓度降至5%，再经同型号的大孔树脂吸附(大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍)，用95%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，得到类白色的EGCG单体重量为2. 96g，检测纯度为99. 8%，含量为99. 0%，按TP精品中EGCG含量58%计算，收得率为50. 5%。实施例8
干茶叶下脚料(绿茶，而非红茶)，100g，粉碎成50目，加入2000ml水，加温至60°C浸泡，调节PH=6，加入由纤维素酶、蛋白酶和果胶酶组成的混合酶(比例I :1 :1)，复合酶用量为茶叶干重的O. 5%，搅拌60min，过滤，重复提取3次，合并滤液经乙酸乙酯萃取后真空浓缩得到茶多酚粗品浓缩物46. 45g。EGCG纯度为25. 88%，含量为8. 562% (见附图2)。取少量粗品浓缩物干燥计算得浓缩物干重是浓缩物的46. 55%。 取茶多酚粗品浓缩物43g(含干重20g)，300ml水溶解，加入CaCl2和ZnCl2混合沉淀剂(混合比例I :I)，Ca2+和Zn2+的量总和为lmol，调节PH=6，搅拌60min，沉淀物过滤、水洗涤，以O. 1%的稀盐酸溶解后直接经AB-8型大孔树脂吸附(大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍)，用2倍量(Ι/kg)树脂体积的水流洗，然后95%乙醇洗脱，收集有效洗脱液，在60°C真空浓缩得到茶多酚精品浓缩物4. 71g。EGCG纯度为66. 38%，含量为56. 851% (见附图3)。取少量精品浓缩物干燥计算得浓缩物干重为浓缩物的45. 2%。。取茶多酚精品浓缩物4. 42g (含干重2g)，加6ml的去离子水溶解，用AB-8型大孔树脂柱吸附，大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍，然后向柱中加入60ml (为大孔树脂体积的3倍量)去离子水，待水从柱下端流完，将40ml的10%乙醇水溶液从柱顶端往下流洗，接着用40ml的20%乙醇水溶液、40ml的30%乙醇水溶液、40ml的95%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG纯度为98%以上的洗脱液，往洗脱液中加水使乙醇浓度降至5%，再经同型号的大孔树脂吸附(大孔树脂的重量是溶液中固体重量的10倍)，用95%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，得到类白色的EGCG单体重量为O. 63g，检测纯度为99. 13%,含量为98. 738% (见附图 4)。按干茶叶含茶多酚30%、含儿茶素22%计，通过如下计算，
EGCG 收得率=0. 63*98. 738%* (4. 71/4. 42) * (46. 45/43) / (100*22%) *100%=3· 25%
权利要求
1.从茶叶加工下脚料中制备高纯度单体儿茶素的方法，包括提取茶多酚、分离出儿茶素并进行纯化，其特征在于エ艺过程包含 A.原料粉碎； B.加水在酸性条件下加入由纤维素酶、蛋白酶和果胶酶组成的复合酶进行酶解； C.过滤后酶解液用こ酸こ酯萃取，萃取液浓缩和/或干燥，得茶多酚粗品； D.将浓缩或/和干燥物加水成液体，调节PH5.6 6. 5，加入CaCl2和ZnCl2混合沉淀剂； E.滤出的沉淀物以稀盐酸转溶后直接经大孔树脂吸附，水洗后，再こ醇洗脱，浓缩こ醇洗脱液和/或干燥，得茶多酚精品；然后， F.加水成液体，用大孔树脂吸附，水洗后再用こ醇水溶液洗脱，分别收集含EGCG，GCG,ECG纯度为98%以上的洗脱液；然后， G.加水使各洗脱液的こ醇浓度为I 10%;然后， H.再分别用与F同型号的大孔树脂吸附，用90 99.5%こ醇洗脱，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥得成品。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在干原料取自新鮮茶叶、剪枝茶叶、非发酵过的茶叶加工下脚料，粉碎至20 80目。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于在Bエ序加水量为茶叶干重的10 20倍，PH=3 6. 5，复合酶组成比例为纤维素酶蛋白酶果胶酶=0. I 5 :0. I 5 :0. I 5，复合酶用量为茶叶干重的O. I 1%，温度40 65°C。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于在Dエ序加水量为粗品干重的10 20倍，CaCl2和ZnCl2混合沉淀剂的混合比例=1 :0. 01 99，Ca2+和Zn2+的量和与溶液中茶多酌·的量=O. 01 O. 05 (mol/g)。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于在Eエ序稀盐酸的浓度为O.1% 10%，水洗的水用量为大孔树脂体积的I 5倍，こ醇浓度为90% 99. 5%。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于在Fエ序加水量为精品干重的2 5倍，水洗的水为去离子水，其用量为大孔树脂体积的I 5倍，之后こ醇水溶液洗脱的程序为用I 3倍树脂体积量的10%こ醇水溶液洗脱——用I 3倍树脂体积量的20%こ醇水溶液洗脱——用I 3倍树脂体积量的30%こ醇水溶液洗脱——用I 3倍树脂体积量的90% 99. 5%こ醇洗柱。
7.根据权利要求1、5或6所述的方法，其特征在于大孔树脂选自非极性大孔树脂、弱极性大孔树脂和氢键型大孔吸附树脂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于大孔树脂选自DlOl、AB-8、DM130、HPD826、ADS-17。
全文摘要
从茶叶加工下脚料中制备高纯度单体儿茶素的方法，包括提取茶多酚、分离出儿茶素并进行纯化，其工艺过程包含以新鲜茶叶、剪枝茶叶、非发酵过茶叶的加工下脚料为原料，通过加入由纤维素酶、蛋白酶和果胶酶组成的复合酶进行酶解辅助提取茶多酚，然后用由CaCl2和ZnCl2组成的混合沉淀剂对茶多酚进行沉淀、大孔树脂层析柱一次分离、大孔树脂层析柱二次纯化，得到高纯度单体EGCG。本发明不用氯仿，从提取到精制到纯化过程衔接紧密，产品质量好，得率高。
文档编号C07D311/62GK102702163SQ20121017830
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者易建平, 李健, 王家祥 申请人:广西济康生物科技有限公司