一种从发酵液中分离纯化wf11899a的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法，其包含步骤：（1）用C1～C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液0.5～3h后，固液分离；（2）去除液体部分中的醇或酮后，过大孔吸附树脂，以甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液减压浓缩，得浓缩液；（3）将浓缩液通过聚苯乙烯反相色谱柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液洗脱，HPLC跟踪检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液，并减压浓缩得浓缩液；（4）将步骤（3）所得的浓缩液上样于聚苯乙烯反相色谱柱，用纯水冲洗脱盐，然后以纯甲醇洗脱，所得洗脱液即为含有WF11899A的洗脱液。本发明方法对WF11899A的提取纯度较高，收率高，纯化工艺简单，为从发酵液中分离纯化WF11899A提供了一种高效率低成本的工业化方法。
【专利说明】—种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法。【背景技术】
[0002]WF11899A (FR901379)最初是从腔胞纲菌 Coleophoma sp.F-11899 的发酵培养液中分离得到的一种脂肽类活性化合物，其分子式为C51H82N8O21S,经过结构修饰改造可得到一种抗真菌抗生素米卡芬净(Micafungin, MFG, FK463)。但是近年来,在其他近缘种中也逐渐发现一些菌株可以合成WF11899A及其结构类似物。
[0003]米卡芬净是日本藤泽公司开发的一类新型水溶性棘白菌素类抗真菌抗生素，具有良好的医用市场前景。其作用机制为通过非竞争性抑制β-α，3)-葡聚糖合成酶的活性来抑制真菌细胞壁合成，且对人体正常细胞影响不大。临床实验表明其对由念珠菌属、曲霉菌属引起的深度真菌感染有广谱抗菌作用，对耐氟康唑、依曲康唑的念珠菌亦有作用。
[0004]目前关于WF11899A的纯化方法主要是硅胶柱层析和离心分配色谱。文献“WF11899A，B and C，novel antifungal lipopeptides.1.Taxonomy, fermentation, isolation and physico-chemical properties，，(((the Journal ofAntibiotics)), 1994, 47 (10):1084-1091)和欧洲专利 EP0431350A1 中都公布了一种从 Coleophoma sp.F-11899 发酵液中分离纯化WF11899A的方法:发酵液用等体积的丙酮浸泡2h，过滤后去除丙酮。乙酸乙酯洗涤2次，活性物质萃取至正丁醇相，处理后上样于Si 60硅胶柱，利用CH2C12-甲醇混合液洗脱。浓缩后溶解在50% (体积百分比，下同)甲醇水溶液中，过ODS反相柱，用80%甲醇水溶液洗脱，再利用离心分配色谱进一步纯化。包含WF11899A的目标组分液富集后，再上样于硅胶柱、ODS反相柱，得到WF11899A洗脱液。干燥富集后溶于水，调pH至7.0，冷冻干燥后制得白色粉末WF11899A。但是这种方法存在以下缺点:1)分离纯化步骤较多，操作复杂；
·2)吸附过程中存在不可逆吸附，收率较低。因此，现有技术中关于WF11899A的分离纯化方法均不利于在工业生产上推广应用。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的上述缺陷而提供一种高效率、低成本的从含WF11899A的发酵液中分离纯化WF11899A的方法。
[0006]本发明提供的技术方案之一是:一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法，其包括如下步骤:
[0007](I)用Cl~C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液0.5~3h后，将发酵液进行固液分离，取液体部分；所述的Cl~C4的醇或酮与含WF11899A的发酵液的体积比为1:
2 ~3: I ；
[0008](2)去除步骤(1)得到的液体部分中的Cl~C4的醇或酮后，过大孔吸附树脂，以甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，并减压浓缩，得浓缩液；
[0009](3)将步骤(2)所得的浓缩液通过聚苯乙烯反相色谱柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液洗脱，对洗脱过程进行HPLC跟踪检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液，并减压浓缩，得浓缩液；在所述的乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液中，乙腈的体积百分比为40%~60%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.4%~0.6% ；
[0010](4)将步骤(3)所得的浓缩液上样于聚苯乙烯反相色谱柱，用纯水冲洗脱盐，然后以纯甲醇洗脱，所得洗脱液即为含有WF11899A的洗脱液。
[0011]本发明中，步骤(1)所述的含WFl 1899A的发酵液可以是任何已知的含有WFl 1899A的菌体发酵液，优选Coleophoma sp.F-11899发酵液。所述的Coleophoma sp.F-11899发酵液可以通过现有技术中常规的培养Coleophoma sp.F-11899的培养基培养获得，较佳地如欧洲专利EP0431350A1中公开的培养基配方，具体包括:斜面、平板培养基配方为(g/L):玉米粉17、KH2PO4 0.3、MgSO4.7H20 0.3、琼脂20、pH 6.5 ;种子培养基配方为(g/L):蔗糖40、棉籽蛋白粉20、干酵母粉10、蛋白胨10、KH2PO4 2、CaCO3 2、pH自然，另加入1%。(v/v)的Tween-80 ;发酵培养基配方为(g/L):可溶性淀粉60、葡萄糖10、小麦胚芽粉10、棉籽蛋白粉 5, KH2PO4 20, Na2HPO4.2H20 15, MgSO4.7H20 0.5、ZnSO4.7H20 UpH 自然。
[0012]步骤(1)所述的固液分离的方法可以是已知的任何可以使菌体发酵液实现固液分离的方法，如离心分离法、过滤法、静置沉淀法等，本发明优选离心分离法；所述离心分离法为本领域常规的离心操作；较佳地，所述离心分离法的条件为以2000~6000r/min离心10~40min ;更佳地,所述离心分离法的条件为以4000r/min离心20min。所述Cl~C4的醇或酮可以是本领域常规，较佳地选自甲醇、乙醇、丙酮和正丁醇中的任一种，优选丙酮。所述用Cl~C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液的时间较佳地为1.5~3h，更佳地为2h。
[0013]本发明步骤(2)中，所述的大孔吸附树脂可以为非极性、弱极性或中等极性大孔吸附树脂，优选X-5、XAD-2、XAD-7和ADS-17中的任一种。所述的甲醇水溶液中甲醇的体积百分比较佳地为60%~100%，更佳的为85~95%。所述的去除步骤(1)得到的液体部分中的Cl~C4的醇或酮的方式可以是本领域常规的方式，优选减压去除。
[0014]本发明步骤(3)中，所述的聚苯乙烯反相色谱柱可以是本领域常规的聚苯乙烯反相色谱柱，优选PS25-300或NMPS-100。在所述的乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液中，乙腈的体积百分比优选40~45%，磷酸二氢铵的质量百分比优选0.5%。
[0015]本发明步骤(4)中，所述的HPLC的检测条件为本领域常规的HPLC检测条件，较佳地为=Agilent XDB-C18柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液(其中，乙腈的体积百分比为45%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%)为流动相，流速为1.0ml/min,进样量20 μ 1，柱温30°C，检测波长212nm。在所述脱盐的处理过程中，纯水体积较佳地为柱体积的2~3倍。
[0016]本发明中，较佳地，在步骤(4)之后还包括步骤(5):将步骤(4)所得的含有WF11899A的洗脱液通过旋转蒸发并进行真空干燥，从而得到白色粉末状固体，即WF11899A产品。
[0017]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0018]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0019]本发明的积极进步效果在于:根据本发明方法可有效地将WF11899A从Coleophoma sp.F-11899发酵液等含有WF11899A的发酵液中分离出来，其中WF11899A的纯度可达到91%以上，收率可达到70%以上。与现有技术相比，本发明方法对WFl 1899A的提取纯度较高，收率高，纯化工艺简单，成本较低，为从发酵液中分离WF11899A提供了一种高效率低成本的工业化方法。
【具体实施方式】
[0020]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0021]下述实施例中，部分材料和设备的来源如下:
[0022]1.大孔吸附树脂
[0023](I) X-5:日本三菱化学株式会社产品；
[0024](2 ) XAD-2、XAD-7:美国罗门哈斯产品；
[0025](3)ADS-17:天津南开和成科技有限公司产品。
[0026]2.聚苯乙烯反相树脂:
[0027]PS25-300、NMPS-100:天津南开和成科技有限公司产品。
[0028]在下述实施例中，含有WF11899A的发酵液的获得按如下方式进行。
[0029]菌种:Coleophomasp.F-11899。
[0030]将经过生产能力·验证、生长良好的菌种Coleophoma sp.F-11899,以脱脂牛奶作为保护剂，用真空冷冻的方式保存。使用时将菌种转接到平板培养基，28°C培养6天，然后分离纯化I次，将合格菌种转接到斜面培养基，28°C培养6天，保存于4°C冰箱，7天内可随时作为发酵培养菌种。发酵种子培养温度为28°C,摇瓶培养时间4天，转速为240r/min。种子罐的培养时间随种子罐的大小而变，以种子质量为最终控制标准。在本实施方式中，由于实验室主要是发酵小试阶段，采用5L或IOL种子罐，装液量在50%左右，温度为28°C，转速在220r/min-240r/min，培养时间为4_5天。在发酵过程中，培养温度为28°C，调控溶氧、搅拌转速、通气量等参数，并补加葡萄糖、氨基酸和水。当发酵液中的WF11899A的效价不再有明显的上升趋势、其他发酵参数表现为发酵已接近终结阶段时就可以放罐，发酵时间一般为9天左右。
[0031]以上工作中所用培养基引入欧洲专利EP0431350A1中公开的培养基配方，具体如下:斜面、平板培养基配方为(g/L):玉米粉17、KH2PO4 0.3、MgSO4.7H20 0.3、琼脂20、pH
6.5 ;种子培养基配方为(g/L):蔗糖40、棉籽蛋白粉20、干酵母粉10、蛋白胨10、KH2PO4 2、CaCO3 2、pH自然，另加入1%。(v/v)的Tween-80 ;发酵培养基配方为(g/L):可溶性淀粉60、葡萄糖 10、小麦胚芽粉 10、棉籽蛋白粉 5、KH2PO4 20、Na2HPO4.2H20 15、MgSO4.7H20 0.5、ZnSO4.7H20 1、pH 自然。
[0032]需要说明的是，通过发酵产生WF11899A的其他菌株的发酵液也适用于本发明的方法。
[0033]实施例1
[0034]Coleophoma sp.F-11899 发酵液 500ml,加入 500ml 丙丽，浸泡提取 1.5h, 4000r/min离心20min得上清液，其中WF11899A的浓度为260μ g/ml。上清液减压去除丙酮后，过ADS-17大孔吸附树脂，以60%的甲醇水溶液进行洗脱，流速为2BV，收集洗脱液600ml。洗脱液减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液(其中，乙腈的体积百分比为40%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%)进行洗脱，线性流速为lOcm/h，并对洗脱过程进行HPLC检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液300ml，其中WF11899A的浓度为368μ g/ml。减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，先以200ml纯水冲洗脱盐，再以纯甲醇冲洗，收集洗脱液，旋蒸得到固体，真空干燥得到白色粉末状固体WF11899A 116mg,纯度为91.7%，收率为82.1%。
[0035]实施例2
[0036]Coleophoma sp.F-11899 发酵液4.5L,加入 2.25L丙酮，浸泡提取 3h,4000r/min离心20min得上清液，其中WF11899A的浓度为400μ g/ml。上清液减压去除丙酮后，过XAD-7大孔吸附树脂，以90%甲醇水溶液进行洗脱，流速为3BV，收集洗脱液600ml。洗脱液减压浓缩后，过PS25-300反相树脂，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液(其中，乙腈的体积百分比为45%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.4%)进行洗脱，线性流速为8cm/h，并对洗脱过程进行HPLC检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液530ml，其中WF11899A的浓度为1372 μ g/ml。减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，先以500ml纯水冲洗脱盐，再以纯甲醇冲洗，收集洗脱液，旋蒸得到固体，真空干燥得到白色粉末状固体WF11899A 796mg,纯度为91.0%，收率为 80.5%ο
[0037]实施例3
[0038]Coleophoma sp.F-11899 发酵液 10.0L，加入 30.0L 丙酮，浸泡提取 0.5h,6000r/min离心10min得上清液，其中WF11899A的浓度为78.7 μ g/ml。上清液减压去除丙酮后，过X-5大孔吸附树脂，以100%甲醇进行洗脱，流速为2BV，收集洗脱液1200ml。洗脱液减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液(其中，乙腈的体积百分比为60%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.6%)进行洗脱，线性流速为lOcm/h，并对洗脱过程进行HPLC检测，分段收 集WFl 1899A纯度大于90%的洗脱液780ml，其中WFl 1899A的浓度为2260 μ g/ml。减压浓缩后，过PS25-300反相树脂，先以800ml纯水冲洗脱盐，再以纯甲醇冲洗，收集洗脱液，旋蒸得到固体，真空干燥后得到白色粉末状固体WF11899A 1941mg,纯度为91.3%，收率为75.1%。
[0039]实施例4
[0040]Coleophoma sp.F-11899 发酵液 10.0L，加入 10.0L 甲醇，浸泡提取 2h，2000r/min离心40min得上清液，其中WF11899A的浓度为162 μ g/ml。上清液减压去除丙酮后，过XAD-2大孔吸附树脂，以90%甲醇水溶液进行洗脱，流速为2BV，收集洗脱液800ml。洗脱液减压浓缩后，过PS25-300反相树脂，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液(其中，乙腈的体积百分比为45%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%)进行洗脱，线性流速为lOcm/h，并对洗脱过程进行HPLC检测，分段收集WFl 1899A纯度大于90%的洗脱液530ml，其中WFl 1899A的浓度为2256 μ g/ml。减压浓缩后，过PS25-300反相树脂，先以400ml纯水冲洗脱盐，再以纯甲醇冲洗，收集洗脱液，旋蒸得到固体，真空干燥后得到白色粉末状固体WF11899A 1236mg,纯度为92%，收率为70.2%。
[0041]实施例5
[0042]Coleophoma sp.F-11899 发酵液 500ml,加入 500ml 乙醇，浸泡提取 1.5h, 4000r/min离心20min得上清液，其中WF11899A的浓度为200 μ g/ml。上清液减压去除丙酮后，过ADS-17大孔吸附树脂，以60%的甲醇水溶液进行洗脱，流速为3BV，收集洗脱液500ml。洗脱液减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液(其中，乙腈的体积百分比为50%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%)进行洗脱，线性流速为lOcm/h，并对洗脱过程进行HPLC检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液300ml，其中WF11899A的浓度为309 μ g/ml。减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，先以300ml纯水冲洗脱盐，再以纯甲醇冲洗，收集洗脱液，旋蒸得到固体，真空干燥后得到白色粉末状固体WF11899A 89.7mg,纯度为90.3%，收率为81%。
[0043]实施例6
[0044]Coleophoma sp.F-11899 发酵液 5L,加入 5L 正丁醇，浸泡提取 2h, 4000r/min 离心20min得上清液，其中WF11899A的浓度为USμg/ml。上清液减压去除丙酮后，过ADS-17大孔吸附树脂，以60%的甲醇水溶液进行洗脱，流速为2BV，收集洗脱液900ml。洗脱液减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液(其中，乙腈的体积百分比为40%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%)进行洗脱，线性流速为lOcm/h，并对洗脱过程进行HPLC检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液500ml，其中WF11899A的浓度为1087μ g/ml。减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，先以400ml纯水冲洗脱盐，再以纯甲醇冲洗，收集洗脱液，旋蒸得到固体，真空干燥后得到白色粉末状固体WF11899A 522mg,纯度为91%，收率 为76.0%。
【权利要求】
1.一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法，其特征在于，其包括如下步骤: (1)用Cl~C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液0.5~3h后，将发酵液进行固液分离，取液体部分；所述的Cl~C4的醇或酮与含WF11899A的发酵液的体积比为1: 2~3:1; (2)去除步骤(1)得到的液体部分中的Cl~C4的醇或酮后，过大孔吸附树脂，以甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，并减压浓缩，得浓缩液； (3)将步骤(2)所得的浓缩液通过聚苯乙烯反相色谱柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液洗脱，对洗脱过程进行HPLC跟踪检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液，并减压浓缩，得浓缩液；在所述的乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液中，乙腈的体积百分比为40%~60%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.4%~0.6% ； (4)将步骤(3)所得的浓缩液上样于聚苯乙烯反相色谱柱，用纯水冲洗脱盐，然后以纯甲醇洗脱，所得洗脱液即为含有WF11899A的洗脱液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的含WF11899A的发酵液为Coleophoma sp.F-11899 发酵液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的固液分离的方法为离心分离法。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于,所述离心分离法的条件为以2000~6000r/min 离心 10 ~40min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述Cl~C4的醇或酮选自甲醇、乙醇、丙酮和正丁醇中的任一·种。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的用Cl~C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液的时间为1.5~3h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的大孔吸附树脂为X-5、XAD-2、XAD-7和ADS-17中的任一种；所述的甲醇水溶液中甲醇的体积百分比为60%~100%。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述的聚苯乙烯反相色谱柱为 PS25-300 或 NMPS-100。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中所述的乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液中，乙腈的体积百分比为40~45%,磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)之后还包括步骤(5):将步骤(4)所得的洗脱液通过旋转蒸发并进行真空干燥，从而得到白色粉末状固体，即WF11899A女口广叩ο
【文档编号】C07K7/56GK103848900SQ201210514096
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月4日 优先权日:2012年12月4日
【发明者】芦现杰, 胡海峰, 朱宝泉, 张长清 申请人:上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院