一种双水相体系分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法
【专利摘要】本发明公开了一种双水相体系分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，包括以下步骤：(1)配液：以表没食子儿茶素没食子酸酯的含量为40～70％的儿茶素为原料，将其溶解在乙醇的水溶液中，得到深茶红色溶液；(2)双水相分离：将磷酸氢二钾溶解在水中，然后向溶液中加入有机溶剂，形成双水相体系，将步骤(1)得到的溶液加入该双水相体系，用5～15％的盐酸溶液调节pH值至6～7，用离心机以转速为1000～2000转／分钟的转速离心分离2～5分钟，分离有机相和水相，EGCG在有机相富集，杂质在水相富集；(3)浓缩干燥：将有机相旋转蒸发除去溶剂，得到黄色固体结晶。采用本发明获得的表没食子儿茶素没食子酸酯的纯度高，杂质项检测容易达到食品安全要求。
【专利说明】一种双水相体系分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以普通有机溶剂与盐水形成的双水相体系分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，属于生物化工领域。
【背景技术】
[0002]双水相萃取技术是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下可以形成双水相，由于被分离物在两相中分配不同，便可实现分离。这一技术被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。双水相萃取技术设备投资少，操作简单，该类双水相体系多为聚乙二醇/葡萄糖和聚乙二醇/无机盐两种。由于水溶性高聚物难以挥发，使反萃取必不可少，且盐进入反萃取剂中，对随后的分析测定带来很大的影响。另外水溶性高聚物大多黏度较大，不易定量操作，也给后续工艺带来麻烦。普通的能与水互溶的有机溶剂在无机盐的存在下也可生成双水相体系，并已用于血清铜和血浆铬的形态分析。与水互溶的有机溶剂和盐水相的双水相萃取体系具有价廉、低毒、较易挥发而无需反萃取和避免使用黏稠水溶性高聚物等特点。
[0003]人们对双水相体系中不同种类盐分相能力及不同种类有机溶剂的分相情况进行开展研究。中国科学院化学研究所分子科学中心的王志华、马会民等人研究了异丙醇、乙醇、丙酮等与水互溶的普通有机溶剂的双水相体系，并考察了不同种类盐如(nh4)2so4、Na2CO3' NaNO3> Na3PO4.12H20、Na2SO4' K2HPO4.3H20、NaCl、NaAc 的分相能力差异(应用学，2001，18(3):173-175)。
[0004]儿茶素是一种分布广泛的黄酮化合物，为黄烷醇的衍生物，作为鞣质的前体，广泛分布于于树根、树皮、种子和一些植物的树叶中，特别是在茶叶中占有大量比例(占一片干燥的茶叶的10-20% )。儿茶素广泛存在于植物茶叶中，包括表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) 4种物质，其中以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)含量最高，活性作用最显著，现已被列为一种潜在的抗癌药物在中美等国被研究。近年来随着对其组分化学结构、理化性质及生物活性研究的深入，需要提供大量高纯度儿茶素作为制药原料、标准品或生物合成品的前体物质，新的领域对产品总儿茶素含量，特别是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的含量提出了更高的要求。
[0005]关于提纯制备EGCG的研究，主要还是以葡聚糖凝胶层析、色谱、树脂分离为主。原理是利用儿茶素各单体之间的性质差异，选择不同的吸脱附剂，使之得到分离。例如专利文献CN101386614A公开了一种树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，利用吸附分离高分子材料对各儿茶素单体及色素吸附选择性的不同，进行柱色谱分离，并结合膜分离技术、凝胶色谱分离技术制备高纯度EGCG单体。
[0006]汪健等报道将粗制的茶多酚溶于未饱和的食盐水中，除去沉渣，然后再加食盐析出多酚类物质，再用乙醚抽提，冷冻干燥后可制得纯品(适用技术荟萃(工业)，1998:15)。严明潮、罗明志研究了盐析对儿茶素提取的影响。盐析纯化儿茶素的工艺流程为:茶多酚粗提液-盐析-过滤-(滤液)乙酸乙酯萃取回收-浓缩-干燥-成品。该研究发现:在乙酸乙酯萃取前的茶汤中作盐析处理，可对儿茶素制品的化学组成产生影响。在较低浓度(NaCl<5% )时，适当增加盐浓度有利于酯溶性儿茶素OBEGCG)及儿茶素总量的提高，但达到一定的盐浓度后，浓度的增加则不利于儿茶素纯度的提高(中国茶叶，1999，(4):29~29)。专利文献CN1367171A公开了一种高含量EGCG儿茶素的提取方法，经过一系列惰性溶剂多步逆流萃取后，调整溶液的PH值在2.5~7.5之间，进行二价或三价金属盐沉淀反应，沉淀经过滤、热水洗涤和酸溶后，用乙酸乙酯萃取，萃取的有机溶剂相进行水洗脱酸、减压浓缩、重结晶的结晶物经过滤、冷冻双重水洗涤，最后进行冷冻干燥。儿茶素中EGCg有效含量达90%以上，可直接用于药物原料。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种双水相体系分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，该方法工艺简单、不使用有毒有机溶剂，产物纯度高。
[0008]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]一种双水相体系分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，该方法包括以下步骤:
[0010](I)配液:以表没食子儿茶素 没食子酸酯的含量为40~70%的儿茶素为原料，将其溶解在乙醇的水溶液中，得到深茶红色溶液；
[0011](2)双水相分离:将磷酸氢二钾溶解在水中，然后向溶液中加入有机溶剂，形成双水相体系，将步骤(1)得到的溶液加入该双水相体系，用5~15%的盐酸溶液调节pH值至6~7，用离心机以转速为1000~2000转/分钟的转速离心分离2~5分钟，分离有机相和水相，表没食子儿茶素没食子酸酯在有机相富集，杂质在水相富集；
[0012](3)浓缩干燥:将有机相旋转蒸发除去溶剂，得到黄色表没食子儿茶素没食子酸酷固体结晶。
[0013]在步骤(1)中，所述乙醇的水溶液中乙醇的质量百分比浓度为10~40%，且所得溶液中儿茶素原料的浓度为2~5g / L。
[0014]在步骤(2)中，有机溶剂与水的体积比为2: 8~8: 2，例如可以为2: 8、3: 7、
4: 6、5: 5、6: 4、7: 3、8: 2等，且每毫升水溶解0.1~0.9g磷酸氢二钾。所述有机溶剂优选为丙酮或异丙醇。
[0015]本发明的优点在于:
[0016]与现有分离方法比较，本发明采用与水互溶的有机溶剂新型双水相萃取体系:SP丙酮/盐水体系或异丙醇/盐水体系分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯，与水互溶的有机溶剂价廉、无毒、较易挥发而无需反萃取，与以往采用的聚乙二醇的双水相体系分离纯化过程相比，避免使用粘稠水溶性高聚物，易回收、易处理、环保、操作简便。采用本发明获得的表没食子儿茶素没食子酸酯的纯度高，不夹杂以往分离树脂中的大分子聚合物，杂质项检测容易达到食品安全要求。
【具体实施方式】[0017]以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。其中所用的丙酮、乙醇、异丙醇、K2HPO4均为试剂级。
[0018]实施例1
[0019]I)配液:选EGCG含量60%的儿茶素为原料，称取0.05g，用10mL30%的乙醇水溶
液溶解，得深茶红色的儿茶素药液。
[0020]2)双水相分离:采用丙酮/ K2HPO4双水相体系萃取EGCG，其制备过程为:每毫升水中加入0.25gK2HP04，搅拌，使磷酸盐充分溶解，然后加入丙酮形成双水相体系，丙酮与水的体积比为8: 2。加入儿茶素药液于双水相体系中，用10%盐酸调节pH值，使pH值在6~7范围内，用离心机分离，双水相分配系数(K=Cwiwa / C7wa)为4.18，EGCG在有机相的收率Y= (C有机相X V有机相)/ 50mgX60% =98.43%。
[0021]3)浓缩干燥:利用分液漏斗把丙酮相分离出来，旋蒸得黄色固体结晶29.33mg，利用紫外分光光度计测得丙酮相得到的EGCG的纯度为89.68%。
[0022]实施例2
[0023]I)配液:选EGCG含量60%的儿茶素为原料，称取0.5g，用10mL30%的乙醇水溶液
溶解，得深茶红色的儿茶素药液。
[0024]2)双水相分离:采用丙酮/ K2HPO4双水相体系萃取EGCG，其制备过程为:每毫升水中加入0.5gK2HP04,搅拌，使磷酸盐充分溶解，然后加入丙酮形成双水相体系，丙酮与水的体积比为7: 3。加入儿茶素`药液于双水相体系中，用10%盐酸调节pH值，使pH值在6~7范围内，用离心机分离，双水相分配系数为2.32，EGCG在有机相的收率Y=95.53%。
[0025]3)浓缩干燥:利用分液漏斗把丙酮相分离出来，旋蒸得黄色固体结晶23.83mg，EGCG 纯度为 80.98%。
[0026]实施例3
[0027]I)配液:选EGCG含量60%的儿茶素为原料，称取0.5g，用10mL30%的乙醇水溶液
溶解，得深茶红色的儿茶素药液。
[0028]2)双水相分离:采用丙酮/ K2HPO4双水相体系萃取EGCG，其制备过程为:每毫升水中加入0.75g K2HPO4，搅拌，使磷酸盐充分溶解，然后加入丙酮形成双水相体系，丙酮与水的体积比为6: 4。加入儿茶素药液于双水相体系中，用10%盐酸调节pH值，使pH值在6~7范围内，用离心机分离，双水相分配系数为2.59，EGCG在有机相的收率Y=91.81%。
[0029]3)浓缩干燥:利用分液漏斗把丙酮相分离出来，旋蒸得黄色固体结晶21.86mg,EGCG 纯度为 81.77%o
[0030]实施例4
[0031]I)配液:选EGCG含量60%的儿茶素为原料，称取0.5g，用10mL30%的乙醇水溶液
溶解，得深茶红色的儿茶素药液。
[0032]2)双水相分离:采用异丙醇/ K2HPO4体系萃取EGCG，其制备过程为:每毫升水中加入0.75g K2HPO4，搅拌，使磷酸盐充分溶解，然后加入异丙醇形成双水相体系，异丙醇与水的体积比为8: 2。加入儿茶素药液于双水相体系中，用10%盐酸调节pH值，使pH值在6~7范围内，用离心机分离，双水相的分配系数为1.46，EGCG在有机相的收率Y=88.46%。
[0033]3)浓缩干燥:利用分液漏斗把异丙醇相分离出来，旋蒸得黄色固体结晶17.99mg,EGCG 纯度为 78.34%。
【权利要求】
1.一种双水相体系分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)配液:以表没食子儿茶素没食子酸酯的含量为40~70%的儿茶素为原料，将其溶解在乙醇的水溶液中，得到深茶红色溶液； (2)双水相分离:将磷酸氢二钾溶解在水中，然后向溶液中加入有机溶剂，形成双水相体系，将步骤(1)得到的溶液加入该双水相体系，用5~15%的盐酸溶液调节pH值至6~7，用离心机以转速为1000~2000转/分钟的转速离心分离2~5分钟，分离有机相和水相，表没食子儿茶素没食子酸酯在有机相富集，杂质在水相富集； (3)浓缩干燥:将有机相旋转蒸发除去溶剂，得到黄色表没食子儿茶素没食子酸酯固体结晶。
2.根据权利要求1所述的双水相体系分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述乙醇的水溶液中乙醇的质量百分比浓度为10~40%，且所得溶液中儿茶素原料的浓度为2~5g / L。
3.根据权利要求1所述的双水相体系分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，在步骤(2)中，有机溶剂与水的体积比为2: 8~8: 2，且每毫升水溶解0.1~0.9g磷酸氢二钾。
4.根据权利要求3所述的双水相体系分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，有机溶剂与水的体积比为2: 8、3: 7、4: 6、5: 5、6: 4、7: 3或8: 2。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的双水相体系分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，所述有机溶剂为丙酮或异丙醇。
【文档编号】C07D311/62GK103804336SQ201410054314
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2014年2月18日
【发明者】霍清, 杨晓芳 申请人:北京联合大学