枯草芽孢杆菌BS01与灵芝孢子粉的组合物在改善睡眠中的应用的制作方法与工艺

本发明涉及枯草芽孢杆菌BS01与灵芝孢子粉的组合物在改善睡眠中的应用。

背景技术：
进入21世纪，随着社会竞争的加剧，生活节奏的加快，失眠症的发病率呈上升趋势。医学研究表明，失眠可给人带来焦虑、抑郁、注意力不集中、记忆出现障碍等后果给患者生活带来严重的影响。因此，研究开发改善睡眠的生物制品对预防疾病保护人类的身心健康具有重要的意义。然而，目前改善睡眠的方法研究多集中在安定、褪黑素、苯二氮卓类、非苯二氮卓类(如扎来普隆、唑吡坦、曲唑酮等)、细胞因子及植物提取物等方面。这些物质虽然具有一定改善睡眠的效果，但长期服用会产生依赖性与毒副作用。研制既安全有效又绿色环保的改善睡眠的生物制品成为当前医学研究中的一个重要课题。目前已有研究表明芽孢杆菌具有提高动物生产性能、增加饲料利用率、促进机体免疫、抗菌防病及促进动物胃肠道微生态平衡等功效，在工业、农业、食品、医药和饲料等行业被广泛应用。但国内外还未有对其改善睡眠方面的相关报道。研究发现，作为灵芝种子的灵芝孢子粉具有镇定、安神、脑保护、促进神经再生和改善睡眠质量的作用，并越来越多的被运用在各类保健品中。灵芝孢子粉可通过灵芝多糖调节神经系统影响松果体对褪黑素的分泌从而显著缩短小鼠的睡眠潜伏时间，并且可显著提高戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠发生率。此外，灵芝孢子粉对中枢神经系统有明显的镇静作用，并能增强巴比妥类药物的中枢抑制作用。随着对药物危害的认识，中草药以其无毒害副作用受到人们的青昧。大量研究表明，中药可促进益生菌的增殖，将益生菌与中药联合应用，不仅具有无毒、无害和无污染的特点，而且还可通过相互的促进作用加强疗效。但目前尚未见到枯草芽孢杆菌联合灵芝孢子粉改善睡眠的相关报道，也未见其相关产品。

技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一株枯草芽孢杆菌BS01CCTCCNO:M2012485与灵芝孢子粉的组合物在改善睡眠中的应用。其中，改善睡眠的制品可以是药品、保健品或饮食品。本发明所述的菌株为枯草芽孢杆菌BS01，于2012年11月28日保藏于中国典型培养物中心，保藏号为CCTCCNO:M2012485，地址为：湖北省武汉市武汉大学。本发明参考益生菌可用于临床上预防和治疗动物疾病的思维，从土壤中筛选出耐酸、耐胆盐的枯草芽孢杆菌BS01，然后利用该菌与灵芝孢子粉的组合物在改善睡眠中的应用，证明添加本发明组合物后，可以有效地改善小鼠睡眠质量和提高其抗氧化性能。具体讲，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明获得具有耐酸、耐胆盐的枯草芽孢杆菌BS01的方法是：采集土壤，用蒸馏水稀释后，用不同筛选培养基进行分离培养和鉴定，得到一株耐酸、耐胆盐的枯草芽孢杆菌。通过PCR扩增出该菌株的16SrDNA片段，经测序获得目的基因序列。用美国生物信息学中心（NCBI）的BLAST程序对所初步获得的该菌株的16SrDNA序列进行登录，获得登录号为JQ086378.1(GenBank(Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，与已收录的序列进行核苷酸同源性比较。经过微生物学分类鉴定，确定该分离的菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BS01，该菌株已于2012年11月28日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为：CCTCCNO:M2012485。本发明枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BS01按照常规甘油冷冻方法保藏。本发明也提供枯草芽孢杆菌BS01与灵芝孢子粉的组合物在改善睡眠中的应用。根据国家保健食品管理法规的有关规定，采用昆明小鼠，在饲喂基础日粮的同时，分别用灭菌生理盐水、枯草芽孢杆菌菌液、灵芝孢子粉稀释液及枯草芽孢杆菌菌液联合灵芝孢子粉稀释液连续30天灌胃小鼠，在实验前后分别称量其体重，实验结束后测定睡眠时间、阈下催眠入睡率、丙二醛(MDA)含量及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性等来判断枯草芽孢杆菌BS01CCTCCNO:M2012485联合灵芝孢子粉是否具有改善睡眠的作用。附图说明图1为本发明枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BS01的总DNA的2%琼脂糖凝胶电泳检测图，其中M为λ/HindIIIDNAMarker。图2为本发明枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BS01的16SrRNAPCR产物的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测图，其中M为D2000，N为阴性对照。具体实施方式实施例1样品的采集与分离取土壤0.5g加入放有49.5ml生理盐水并带有玻璃珠的三角瓶中，摇床37℃震荡20min后60℃恒温水浴20min。取0.5ml土壤稀释液做十倍递减稀释到10-5。从10-3～10-5各稀释度取100µL涂布于普通营养琼脂培养基，37℃恒温培养24h。染色镜检单菌落后挑取芽孢杆菌单菌落在普通营养琼脂平板上画线培养，每个单菌落重复平板画线2～3次，直到得到纯的菌株，并编号为芽孢杆菌BS01。将得到的芽孢杆菌BS01接种于营养琼脂斜面，保存备用。实施例2芽孢杆菌BS01菌落特征本发明芽孢杆菌BS01于LB培养基中划线培养，可见菌落呈圆形，表面湿润，边缘不整齐，灰白色或微黄色，挑取单个菌落进行革兰氏染色，染色后呈紫红色短杆菌并见中生或偏生的芽孢，说明本发明菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌。实施例3芽孢杆菌BS01的耐酸实验将芽孢杆菌BS01于LB培养基中37℃过夜培养后3000r/min离心收集菌体，将菌体悬浮于0.05M磷酸缓冲液-pH2.0中培养1-3h，动态检测培养期间活菌数的变化。实验结果显示，pH2.0的缓冲液中3小时后存活率达到81.24%（见表1）。表明本发明菌株BS01具有较强的耐酸性。表1芽孢杆菌BS01的耐酸实验Log10CFU/mL菌株0h1h2h3h存活率（%）芽孢杆菌BS019.017.987.547.3281.24实施例4芽孢杆菌BS01的耐胆盐实验将芽孢杆菌BS01于LB培养基中37℃过夜培养后3000r/min离心收集菌体，将菌体悬浮于与初培养基等体积的含1%胆盐的生理盐水中，37℃作用6h；检测活菌数的变化率。试验结果显示，芽孢杆菌BS01在6小时后存活率达92.45%（见表2）。这表明本发明芽孢杆菌BS01具有较强的胆盐耐受性。表2芽孢杆菌BS01的胆盐耐受结果Log10CFU/mL菌株0h6h存活率（%）芽孢杆菌BS019.018.3392.45实施例5芽孢杆菌BS01的鉴定将芽孢杆菌BS01的基因组总DNA按照（LiM.2003.JournalofMicrobiologyMethods,54:13-20）采用QIAamp®DNAStoolMiniKit提取，用2%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA（见图1）。芽孢杆菌BS01基因组总DNA的16SrDNAV3按照（WalterJ.2001.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,67:2578-2585）方法扩增,PCR产物用1.0%琼脂糖进行凝胶电泳检测（见图2）。纯化后将菌株的16SrRNA的PCR反应产物用ABI3700基因测序仪测序，测序由上海生物技术有限公司完成，测得芽孢杆菌BS01的16SrRNA大部分序列为1006个bp，见核苷酸序列表（见序列表1）。将该芽孢杆菌BS01的16SrRNA序列提交美国生物信息学中心（NCBI）网站，获得登录号为JQ086378.1。在Genbank里搜索出进行blast比对后，与枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）亲缘性最近，同源性高达99％。因此，本发明芽孢杆菌BS01鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，并已于2012年11月28日在位于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏编号为：CCTCCNO:M2012485。本发明枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BS01按照常规甘油冷冻方法保藏。实施例6枯草芽孢杆菌BS01和灵芝孢子粉在改善小鼠睡眠质量及提高抗氧化能力的实验1材料与方法1.1仪器设备及材料高速冷冻离心机；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BS01（由四川农业大学动物微生态中心提供，保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为：CCTCCNO:M2012485，活菌数为1×107CFU/mL）；灵芝孢子粉（购于四川金地菌类有限责任公司）；巴比妥钠；苯巴比妥钠；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒(均购于南京建成生物研究所)。1.2实验动物和饲养管理64只体重为20±1g的小鼠（购于四川农业大学隆鼠家园），预饲一周，随机分为四组，每组16只。动物房条件：温度为23±2℃，1周更换2-3次锯末粉，每天12小时光照。饲料：常规饲料（由四川农业大学隆鼠家园提供）。日常管理：自由进水进食，小鼠灌胃时间为每天16:00，记录每天饲料消耗量，第0、30天称量小鼠体重。1.3动物分组和灌胃安排将小鼠随机分为4组，饲喂相同的常规饲料，具体分组及处理见表3。表3动物分组及处理组别分组灌胃剂量1空白对照组10mL/kg.bw灭菌生理盐水2枯草芽孢杆菌BS01组10mL/kg.bw枯草芽孢杆菌BS01菌液3灵芝孢子粉组0.66g/kg.bw灵芝孢子粉稀释液4混合组10mL/kg.bw枯草芽孢杆菌BS01菌液和0.66g/kg.bw灵芝孢子粉稀释液1.4各项指标检测1.4.1直接睡眠时间的检测：第30天灌胃15min后，观察小鼠的睡眠状况。以翻正反射消失为入睡标志，以翻正反射恢复为苏醒标志，翻正反射消失至恢复这段时间为小鼠的睡眠时间，记录入睡小鼠只数及其睡眠时间。比较各试物对小鼠是否有直接催眠的作用。如果有直接催眠作用则不能将其用作食品添加剂。1.4.2苯巴比妥钠睡眠时间的检测：第30天灌胃15min后，小鼠腹腔注射苯巴比妥钠（100mg/kg.bw）。以小鼠翻正反射消失30s以上作为入睡判断标准，翻正反射再次出现即为小鼠觉醒，记录睡眠时间。1.4.3巴比妥钠阈下剂量催眠率的检测：第30天灌胃15min后，小鼠腹腔注射苯巴比妥钠（80mg/kg.bw），记录60min内入睡小鼠只数。观察试验组是否能够增强阈下巴比妥钠的睡眠效果。1.4.4巴比妥钠睡眠潜伏期的检测：第30天灌胃15min后，小鼠腹腔注射巴比妥钠（280mg/kg.bw），记录从注射到翻正反射消失达1min所需的时间。观察比较试验组是否能够缩短巴比妥钠的睡眠潜伏期。1.4.5血清的制备和抗氧化指标的检测：30天睡眠实验结束后，每组随机选择4只小鼠，眼球采集1.0mL血液，室温放置20min，3000r/min离心10min分离制备血清。按试剂盒说明测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。1.5统计分析用SPSS19.0软件对数据进行方差分析，用LSD进行多重比较。结果用“平均值±标准差”表示。2实验结果2.1枯草芽孢杆菌BS01和灵芝孢子粉对小鼠体重的影响由表4可知，试验前后各组小鼠体重差异均不显著（P＞0.05）。结果表明本发明枯草芽孢杆菌BS01和灵芝孢子粉对小鼠均无明显促生长作用。表4枯草芽孢杆菌BS01和灵芝孢子粉对小鼠体重的影响项目Item对照组芽孢杆菌BS01组灵芝孢子粉组混合组初重/g22.4±1.223.8±1.123.1±1.123.8±1.0末重/g28.8±2.229.6±2.529.3±3.029.4±2.7增重/g6.4±0.45.8±0.36.2±0.55.6±3.02.2枯草芽孢杆菌BS01和灵芝孢子粉对小鼠睡眠作用的影响由表5可知，在延长苯巴比妥钠睡眠时间的试验中，与对照组相比，各实验组睡眠时间均有极显著的增加（P<0.01），各实验组睡眠时间分别延长了22.50%、11.74%和54.40%。在苯巴比妥钠阈下剂量催眠试验中，对照组小鼠30min内的入睡率为12.50%与对照组相比，实验组入睡率均显著提高，且以混合组的效果最佳，其入睡率分别为31.25%、43.75%、56.25%。巴比妥钠睡眠潜伏期试验中，对照组小鼠的睡眠潜伏期最长，达40.29min，混合组睡眠潜伏期最短，为29.29min，缩短了27.30%（P<0.01）。结果表明本发明枯草芽孢杆菌BS01和灵芝孢子粉具有促进睡眠的作用。表5枯草芽孢杆菌BS01和灵芝孢子粉对小鼠睡眠作用的影响项目Item对照组芽孢杆菌BS01组灵芝孢子粉组混合组直接睡眠时间/min0000睡眠时间/min52.26±4.30A75.38±4.34Ba64.00±2.89C80.67±4.70Bb阈下催眠入睡率/%12.5031.2543.7556.25睡眠潜伏/min40.29±2.81A33.14±2.41B33.63±2.00B29.29±1.11C注：同行数据肩注相同字母或无字母表示差异不显著（P>0.05），不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。2.3枯草芽孢杆菌BS01和灵芝孢子粉对小鼠血清抗氧化作用的影响由表6可知，灵芝孢子粉组小鼠血清SOD活性最高，极显著高于对照组（P<0.01），枯草芽孢组和混合组也显著高于对照组（P<0.05），实验组与对照组相比，SOD活性分别提高了14.22%、20.33%、12.61%。灵芝孢子粉组和混合组血清CAT活性极显著高于对照组（P<0.01），芽孢杆菌BS01组显著高于对照组（P<0.05）。各实验组小鼠血清GSH-Px活性均极显著高于对照组（P<0.01），分别提高了32.36%、31.73%、49.27%。实验组血清中MDA含量均低于对照组，但差异不显著（P>0.05）。实验结果表明枯草芽孢杆菌BS01和灵芝孢子粉具有提高血清抗氧化的性能。表6枯草芽孢杆菌BS01和灵芝孢子粉对小鼠血清抗氧化作用的影响项目Items对照组芽孢杆菌BS01组灵芝孢子粉组混合组SOD(U.mL-1)290.96±7.35Aa332.34±28.25ABb350.12±20.40Bb327.66±22.36ABbCAT(U.mL-1)406.48±38.29A417.02±13.31ABa510.04±74.42Bb805.34±38.97CGSH-Px(U.mL-1)4.79±0.95A6.34±0.35Ba6.31±0.67Ba7.15±0.21BbMDA(nmol.mL-1)12.73±0.0311.66±0.2611.37±0.1011.38±0.46注：同行数据肩注相同字母或无字母表示差异不显著（P>0.05），不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。实施例7枯草芽孢杆菌BS01与灵芝孢子粉的组合物配方及制备方法组合物配方：共制100克，每片1克。制法：将枯草芽孢杆菌BS01种子液置于培养基中37℃发酵24h,其中培养基由如下组分组成：蛋白胨10g、葡萄糖5g、磷酸氢二钾0.15g、磷酸二氢钾1.5g、一水硫酸锰1.5g、七水硫酸镁2g、蒸馏水1000ml,PH值为7.0；之后离心分离回收菌体，添加5%的脱脂乳粉和10%的糊精，-45℃条件下采用冷冻干燥工艺获得冻干粉末。冻干粉末与灵芝孢子粉及其他原料按处方配比共同混合后，进行压片，作后用防潮包装物进行严密包装。本发明从枯草芽孢杆菌BS01协同灵芝孢子粉的角度来研究其改善小鼠睡眠和提高血清抗氧化性能的机理。实验证明，其不但可以降低小鼠的睡眠潜伏时间、提高小鼠的睡眠时间和阈下催眠入睡率，且能在小鼠血清抗氧化指标中起到提高CAT、GSH-Px、SOD等酶的活力的作用。以SOD为主的抗氧化酶系统，可以减少活性氧自由基的产生，显著清除机体产生的自由基，阻止自由基对机体的损伤，减少机体的疲劳，从而提高睡眠质量。益生菌与中草药联合制剂作用不仅能防病治病，还具有无毒、无害和无污染的特点，而且还可以通过相互的促进作用来加强疗效，所以其有望成为一种新型改善睡眠的生物制品。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。序列表序列表1〈110〉四川农业大学〈120〉枯草芽孢杆菌BS01与灵芝孢子粉的组合物在改善睡眠中的应用〈160〉1〈210〉1〈211〉1006〈212〉DNA〈213〉枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BS01〈400〉1gggtctataatgcaagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcg60gacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccgg120ggctaataccggataacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggctg180tcacttatggatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggc240aacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccag300actcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaa360cgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagt420gctagttgaataagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgt480gccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagc540gcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcat600tggaaactgggagacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcggtgaaa660tgcgtagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacac720tgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaa780cgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagc840actccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgca900caagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgac960atcctctgaaaaccctagagatagggcttctccttcgggagcagat1006