一种猪圆环病毒II型基因工程亚单位疫苗及其应用的制作方法

本发明涉及生物制药技术领域，具体而言，涉及一种猪圆环病毒II型基因工程亚单位疫苗及其应用。

背景技术：

猪圆环病毒2型(PCV2)引起的猪圆环病毒病(PCVAD)感染已遍布世界各国，引起十分严重的经济损失。PCV2感染猪的免疫功能受到抑制，导致继发感染和严重的临床疾病。有效防控PCV2已成为我国乃至世界养猪业面临的严峻问题，接种疫苗是防控PCV2感染的可靠方法。

我国市场上已有若干全病毒灭活疫苗，虽然全病毒灭活疫苗无致病力，生物学功能相对稳定，但是如果出现灭活不彻底，仍然存在潜在的安全性问题。此外，PCV2病毒的体外培养较困难，病毒滴度低，且很难提高，限制了PCV2全病毒的生产与应用。同理，重组病毒嵌合灭活疫苗也存在着相同的困难与问题。利用PRV构建的PCV2活载体疫苗在预防PCV2感染方面具有很大的应用前景，但是目前此类研究还处于实验室研究阶段，疫苗的免疫原性及效力尚需要进一步研究和观察，而且目前还没有商品化的含有PCV2的活病毒载体疫苗。现有的PCV2重组亚单位疫苗，已经被市场证明有良好的免疫效果。但是目前已有的PCV2重组亚单位疫苗是昆虫细胞系统表达，该工艺生产的重组蛋白能形成天然的VLPs，具有良好的免疫原性，但是该工艺成本较高，不利于疫苗降低成本和推广应用。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供一种猪圆环病毒2型重组CAP 蛋白及重组CAP蛋白的亚单位疫苗。

首先，本发明提供一种猪圆环病毒2型重组CAP蛋白，所述Cap蛋白的C端融合有8个组氨酸标签，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供编码所述重组CAP蛋白的基因。

在本发明一个实施方案中，所述重组CAP蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供含有所述基因的表达载体，以及含有所述表达载体的重组表达菌株。

本发明提供一种猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备方法，其包括培养所述的重组表达菌株，加入IPTG进行诱导表达，获得所述的重组蛋白。

本发明还提供一种猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗，其含有所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白，以及任选地，药学可接受佐剂。

本发明的有益效果：

本发明重组大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白用作亚单位疫苗具有抗原纯度高，安全性好，免疫原性强，且对猪等动物没有致病性，容易通过安全性评价的优点。

实验证明，本发明构建的重组菌株对外源目的蛋白表达稳定。通过小鼠免疫试验证明了该重组蛋白制备的疫苗能够诱导产生高水平的PCV2特异性抗体。

本发明重组大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗与目前应用的PCV2的灭活疫苗相比，该疫苗制备过程相对简单，成本更低，因此在PCV2的防治方面具有更加广阔的应用前景。

附图说明

图1为目的基因与载体构建示意图。

图2为重组质粒pET21a-PCV2-ORF2的Xho I和Nde I双酶切鉴 定。

图3为pET21a-PCV2--ORF2蛋白试表达结果。

图4为PCV2 Cap蛋白HisTrap预装柱纯化。

图5为重组Cap蛋白的Western blotting鉴定。

图6为PCV2 Cap蛋白病毒样颗粒电镜图片。

图7为两种PCV2 Cap蛋白小鼠免疫保护实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1序列合成

通过序列比对，在保证编码的氨基酸相同的前提下改变核苷酸序列，把序列中的稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子，在PCV2ORF2基因序列3’端加6His或8His标签和终止密码子，序列5’端为Nde I限制性内切酶识别位点，3’端为Xho I限制性内切酶识别位点。以上所有序列为人工合成序列。合成序列经Nde I、Xho I双酶切后连接到pET-21a(+)载体(见图1)。

实施例2表达载体pET-21a-PCV2-ORF2的构建

用限制性内切酶Nde I、Xho I酶切重组质粒，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，切胶回收小片段(见图2)，然后亚克隆到线性化的载体pET-21a(+)上，载体线性化过程使用相同的限制性内切酶，连接液转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆子并进行测序验证，在确保阅读框正确后，将重组载体分别命名为pET-21a-PCV2-ORF2-6 His、pET-21a-PCV2-ORF2-8 His，转化到BL21(DE3)感受态细胞中，进行蛋白表达。

实施例3重组蛋白的诱导表达

(1)分别挑取重组表达菌株pET-21a-PCV2-ORF2-6His、pET-21a-PCV2-ORF2-8 His散在单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37℃过夜振摇培养。

(2)将鉴定为阳性的BL21菌液按1:100的比例转接到含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期(OD600达到0.6-0.8)，取100μl样品于无菌Eppendorf管中作为诱导前对照；

(3)向上述菌液中加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG进行重组蛋白的诱导表达，并在加入IPTG后第3、4、5、6、7、8h取样；

(4)4℃12000rpm离心5min收集诱导表达的细菌，PBS重悬，反复洗涤2次；

(5)完全弃上清，用适量PBS重悬细菌沉淀；

(6)将菌液反复冻融3次；

(7)超声波裂解细菌：功率选用200W，在冰盒上操作，超声裂解6s，停顿12s，直至菌液变得清澈；

(8)4℃12000rpm离心20min，分别收集上清与沉淀，将沉淀用与上清等体积的PBS重悬，上清与沉淀悬液各取100μl备用。

(9)SDS-PAGE检测

最终选取OD600达到0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导6h为最佳表达条件(见图3)。

实施例4重组蛋白的大量表达，纯化及抗原性鉴定

重组蛋白的大量表达

(1)复苏：将经过SDS-PAGE电泳鉴定的能可溶性表达Cap蛋白的菌株于-80℃冰箱中取出，按1％比例接种于50mL含有Amp抗生素的LB培养基中，放置于37℃，180r/min摇床上过夜培养；

(2)活化：将过夜复苏的pET-21a-PCV2-ORF2重组菌放置于2L新鲜培养基中，加入Amp抗生素至终浓度为100μg/mL，于37℃摇床上培养至OD值0.6～0.8；

(3)诱导：往OD值达到0.6～0.8的菌液中加入IPTG，使IPTG的终浓度为0.5mmol/L，设置不加IPTG的阴性对照，放置于37℃， 180r/min摇床上培养，诱导6h后将菌液于37℃摇床中取出。

Cap蛋白的亲和层析纯化

(1)集菌：将诱导好的菌液倒入500mL离心筒中，9,000r/min，离心30min；

(2)洗涤菌体：弃掉上清，用A液(150mM NaCl，20mM Tris-base)重悬，12,000r/min，离心20min，重复洗涤一次，收集菌体；

(3)破碎菌体：将收集的菌体用200mL A液重悬，打开低温超高压细胞破碎仪，使用前将仪器工作温度降至4℃。使用时先用三蒸水清洗进样杯两次，再加入A液清洗进样杯，将重悬的菌体倒入清洗后的进样杯中，进行破碎，用干净的离心管收集破碎的菌液，反复2～3次，直至澄清；

(4)离心：将上一步获得的液体于4℃，12,000r/min，离心20min，取上清，用0.22μM滤器过滤，置于冰上备用；

(5)Histrap镍柱：使用前先用去离子水把柱子中的NiSO₄洗掉，再用20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0平衡。抽滤好的蛋白上清用蠕动泵在冷库(4℃)过夜结合Histrap。结合完蛋白上清后，把Histrap卸下，安装到Bio-Rad NGC上，流速2ml/min(Bio-Rad NGC先用20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0洗泵，走平后UV值调零)，用20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0 Buffer洗杂蛋白，冲至UV值较平缓，再用20mM咪唑，20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0洗脱非特异性结合的杂蛋白，冲至UV值较平缓，最后用300mM咪唑，20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0洗脱目的蛋白，冲至UV值较平缓(一般收集到200mAU为止)。取样跑蛋白胶。层析冷柜中透析，用20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0 Buffer透析(透析液应预冷)，透析液体积应为蛋白体积20倍以上(见图4)。

重组蛋白的反应原性鉴定：

采用Western blotting技术验证重组蛋白的反应原性。重组Cap蛋白与抗PCV2的小鼠血清相互作用后，利用化学底物进行显色，可以观察到明显的特异性蛋白条带(见图5)，重组后的Cap蛋白能够和PCV2阳性血清发生特异性相互作用，说明其与天然的Cap蛋白一样，具有作为候选抗原应该具有两种特征之一，即反应原性。

电镜观察重组蛋白形成的VLPs

试验插入了完整的ORF2阅读框，表达完整的Cap蛋白，为Cap蛋白天然形成病毒样颗粒(VLPs)奠定了材料基础。将纯化后的Cap蛋白利用透射电镜技术观察Cap蛋白是否形成了VLPs(见图6)。从图中可以清楚的观察到病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)的存在，颗粒呈典型的二十面体，无囊膜，直径为17～20nm之间，其形态大小与PCV2亲本病毒形成的衣壳样结构相似。

重组蛋白的小鼠免疫试验

将重组蛋白pET-21a-PCV2-ORF2-6 His、pET-21a-PCV2-ORF2-8 His浓度调整为0.25mg/ml，分别与201R佐剂等体积混合，乳化制备疫苗。选取5周龄BALB/c小鼠，每组10只。首免每只背部皮下多点注射疫苗0.1ml，于首免后14d进行加强免疫，加强免疫每只背部皮下多点注射0.1ml疫苗，于首免后的14d、28d小鼠眼眶采血，分离血清，ELISA检测PCV2特异的抗体滴度：用抗原包被液稀释重组抗原至10μg/ml，每孔100μl，4℃过夜，弃包被液，用5％脱脂奶粉37℃封闭2h，PBST洗涤3次，将待检血清做1:200倍稀释，每孔分别加入100μl，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，加入1:10000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG，每孔100μl，37℃孵育45min；PBST洗涤3次，每孔加入TMB显色液100μl，37℃孵育7min，每孔加入50μl 2M H₂SO₄终止反应，在酶标仪上读取OD450值。结果见图7。结果表明，两种重组蛋白均能诱导机体产生抗体反应，在14d时各免疫组抗体水平差异不显著；28d时，各组抗体效价均上升至较高水平，相 比pET-21a-PCV2-ORF2-8 His重组蛋白明显高于pET-21a-PCV2-ORF2-6 His重组蛋白的抗体效价。因此pET-21a-PCV2-ORF2-8 His重组蛋白显示出较好的免疫原性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。