用于克隆全长基因的成套试剂及方法与流程

本发明涉及生物技术领域中用于克隆全长基因的成套试剂及方法。

背景技术：

基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。因此，人们对生物体的研究都集中于对于基因功能的研究。而研究基因的功能的前提是要必须获得候选基因，即需要先进行候选基因的克隆。

伴随着现代分子生物技术的发展，出现了许多获得新基因的方法和手段，如图谱技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、二减法技术以及cDNA文库筛选技术等，但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤繁琐且工作量大等缺点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法，为目前广泛应用的基因全长克隆的方法。

然而，RACE技术中，获得基因的3’端相对比较容易，但是获得基因的5’端就非常困难，经常会有严重的非特异性扩增，增加了很多的克隆筛选的工作。另外，基因5’端的获得，需要购买5’RACE试剂盒，但是不同公司研发的5’RACE试剂盒原理不尽相同，而且价格非常昂贵。目前急需一种可以简单快速克隆基因全长的方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何克隆目的基因的全长。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于克隆全长基因的成套试剂。

本发明所提供的用于克隆全长基因的成套试剂，由接头A和通用引物组成；

所述接头A是由正向链和反向链组成的接头，所述接头A的正向链为序列1所示的单链DNA，所述接头A的反向连为为序列2所示的单链DNA，序列2与序列1的第22-37位反向互补；

所述通用引物为序列1的第1-26位所示的单链DNA。

其中，序列1、2、3和4的从第1位至最后1位的方向均为相应单链DNA的从5’端至3’端的方向。

上述成套试剂中，所述接头A的反向链的5’末端可被磷酸化修饰。

上述成套试剂中，所述基因的来源可为植物、动物、微生物或病毒。

上述成套试剂中，所述接头A和所述通用引物均可独立包装。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述接头A或所述通用引物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了用于克隆全长基因的系统。

本发明所提供的用于克隆全长基因的系统，包括所述成套试剂和用于克隆全长基因的其他试剂和/或仪器。

上述系统中，所述用于克隆全长基因的其他试剂和/或仪器可为提取RNA、合成cDNA第一链或第二链、DNA片段的连接、对含有粘性末端的DNA片段进行末端补平、对DNA片段加dATP、DNA纯化和/或PCR扩增所需的试剂和/或仪器。

上述系统中，所述基因的来源为植物、动物、微生物或病毒。

为解决上述技术问题，本发明还提供了克隆目的基因的方法。

本发明所提供的克隆目的基因的方法，包括如下1)-3)：

1)以生物总RNA为模板获得双链cDNA；

2)对步骤1)的双链cDNA依次进行末端补平、加dATP和连接所述接头A，得到含有接头A的连接产物；

3)以步骤2)的连接产物为模板，用目的基因的特异引物和所述通用引物进行PCR扩增，得到目的基因。

上述方法中，步骤1)还可包括对所述双链cDNA进行纯化。

上述方法中，步骤2)还可包括对所述含有接头A的连接产物进行纯化。

上述方法中，所述1)可包括如下11)和12)：

11)以生物总RNA为模板进行反转录，获取第一链cDNA；

12)以步骤11)的第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，得到双链cDNA。

上述方法的操作流程图如图2所示。

上述方法步骤2)中，所述的末端补平体系可使用NEB公司的Quick Blunting kit进行；所述加dATP的体系可包括：dATP，加A缓冲液，加dATP的聚合酶，所述的dATP的浓度为5mM，所述聚合酶在所述的反应体系中的浓度为0.5U/μl；所述的接头A的连接体系包括：接头A、ATP和连接酶，所述的接头A的浓度为10μM，所述的ATP的浓度为1.7mM，所述连接酶在所述连接体系中的浓度为0.5U/μl。

上述方法步骤3)中，所述的PCR体系包括：引物，聚合酶混合物，以及步骤2)中得到的连接产物。所述的引物的浓度为0.2μM，所述聚合酶混合物在所述PCR体系中所占的50％的体积。

上述方法所述的RNA可为任何单倍体、二倍体或多倍体生物或非生物材料的来源的RNA，如动物、植物、微生物或病毒的RNA。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂、所述接头A、所述通用引 物或所述系统在基因克隆中的应用。

上述应用中，所述基因可来源于植物、动物、微生物或病毒。

本发明中，申请人提出了一种全新的基因克隆的新技术，即使用人工合成接头，同时进行5’和3’末端扩增，而后进行全长扩增的新技术。实验证明，本发明提供的接头分子A，能够连接到双链cDNA片段的两端，运用本发明的克隆方法与用于克隆全长基因的成套试剂，成功的扩增到目的基因的5’和3’末端，并进一步成功的扩增到了全长序列。同时，本发明可以同时进行多个目的基因的扩增。本发明提供了一种方便、高效、特异的基因克隆方法，在未知基因克隆、启动的扩增、未知侧翼序列的获取、插入位点的鉴定等方面均具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为接头A的结构示意图。

图2为基因克隆流程示意图。

图3为提取的构树叶片总RNA的电泳图。

图4为3’端和5’端扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道M为分子量标准，泳道1为5’端扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，泳道2为3’端扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图5为PCR扩增目的基因全长cDNA得到的产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道M为分子量标准。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法，所用核苷酸序列均由上海Invitrogen生物公司合成。所用试剂如无特别说明均为NEB公司的产品，所用水均为超纯水。

用用于克隆全长基因的成套试剂克隆目的基因的方法，包括如下1)-3)：

1)以生物总RNA为模板获得双链cDNA；

2)对步骤1)的双链cDNA依次进行末端补平、加dATP和连接接头A，得到含有接头A的连接产物；

3)以步骤2)的连接产物为模板，用目的基因的特异引物和通用引物进行PCR扩增，得到目的基因。

其中，用于克隆全长基因的成套试剂，由接头A和通用引物组成；

接头A是由正向链和反向链组成的接头，接头A的正向链为序列1所示的单链DNA，接头A的反向连为为序列2所示的单链DNA，序列2与序列1的第22-37位反向互补；

通用引物为序列1的第1-26位所示的单链DNA。

下面以构树的基因A为例，具体阐述克隆基因全长的方法。

实施例1、用于克隆全长基因的成套试剂克隆A

1.总RNA的提取

本实验中使用构树叶片为实验材料，进行总RNA的提取。提取之后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。结果表明，所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNA和18S RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。

2.cDNA第一链的合成

以上述步骤1提取的总RNA为模板，用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesized Kit试剂盒(Takara公司)并参照试剂盒说明书的要求，反转合成其第一链cDNA。反应体系及反应条件如下：Oligo-dT(10pmol/μl)1μl，Total RNA(≤1μg)2μl，dNTP Mixture(10mmol/l each)1.0μl，5×Buffer 4.0μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，PrimeScript RTase(200U/μl)0.5μl，RNase-free distilled water 11μl；65℃5min,42℃45min,70℃15min。将合成的第一链cDNA贮存于-20℃备用。

3.cDNA第二链的合成和纯化

cDNA第二链的合成：第一链合成完毕后，直接进行第二链的合成。在第一链合成体系中分别加入2.5×第二链缓冲液40μl，DNA聚合酶Ⅰ23μl、RNase H 0.8μl、加水至100μl，25℃下放置2小时；70℃，10min后置于冰浴，得到双链cDNA。

双链cDNA的纯化：在第二链合成后的体系中等体积加入酚\氯仿\异戊醇溶液(酚\氯仿\异戊醇溶液中酚、氯仿和异戊醇溶液的体积比为25:24:1)，混匀后，12000g，离心3min；上清液转移至一干净离心管，加2倍体积的乙醇，1/10体积的乙酸钠，-20℃放置30min后12000g，离心15min收集沉淀，使用70％乙醇洗沉淀，干燥，用灭菌的去离子水溶解。

4.双链cDNA末端平齐化、加dATP

对上述步骤3中的纯化后的双链cDNA进行末端补平。反应体系和反应条件如下：纯化产物30μl，10×Blunting Buffer 5μl，1mM dNTP 10μl，Quick Blunting kit Enzyme Mix，1μl，加H₂O 9μl，总体系50μl；反应条件：30℃孵育30min。对反应产物使用天根生化科技(北京)有限公司的普通DNA产物纯化试剂盒进行纯化回收。 然后对回收产物进行加dATP，反应体系和条件如下：回收产物22μl，100mM dATP 1μl，10×NEB Buffer 2 3μl，Klenow exo^-(NEB)(50，000units/ml)0.3μl，H₂O 3.7μl，总体积30μl；反应条件：充分混匀，37℃孵育30min，75℃20min热失活。对反应产物使用天根产物纯化试剂盒进行纯化回收，使用30μl的洗脱缓冲液溶解洗脱，得到回收产物。

5.接头A的连接

将上述步骤4的回收产物，加入接头A，反应体系和条件具体如下:回收产物30μl，100mM dATP 1μl，NEB Buffer 22μl，10μM接头A 2.5μl，(1000u)T4DNA Ligase 0.5μl，加H₂O 15μl，总体积50μl，室温(或16℃)下连接2小时，连接产物65℃20min，连接酶活性失活。对连接反应产物使用天根产物纯化试剂盒进行纯化回收，使用30μl的洗脱缓冲液溶解洗脱。

6、PCR扩增目的片段

将上述步骤5中纯化回收的产物，用于目的基因扩增的PCR反应，得到的目的PCR产物。

5’端扩增反应体系和条件如下：步骤5中纯化回收的产物3μl，GSP Primer(gene-specific primer)1μl，通用引物Primer(序列1的第1-26位所示的单链DNA)1μl，2×Phusion PCR Master Mix 25μl，H₂O 20μl，总共50μl，反应条件为：先98℃预变性1min；然后98℃10s，60℃30s，72℃60s，共35个循环；最后72℃延伸5min。应用于5’端扩增的GSP Primer(即构树基因A的特异引物)的序列为5’-CTAGCTGTAGTGGTAGTGGTAGTAGT-3’。

3’端扩增反应体系和条件如下：步骤5中纯化回收的产物3μl，GSP Primer(gene-specific primer)1μl，通用引物Primer(序列1的第1-26位所示的单链DNA)1μl，2×Phusion PCR Master Mix 25μl，H₂O 20μl，总共50μl，反应条件为：先98℃预变性1min；然后98℃10s，60℃30s，72℃60s，共35个循环；最后72℃延伸5min。应用于3’端扩增的GSP Primer(即构树基因A的特异引物)的序列为5’-CCCTACTAGCTGCAGTACTCTTGCAGAG-3’。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。其中，泳道M为TRANS2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1和2分别为5’端扩增和3’端扩增的PCR扩增产物。回收并纯化PCR扩增产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，对测序结果进行BLAST分析。

利用上述获得的5’和3’端片段之间的重叠区，借助Contig软件拼接得到的目的 基因的全长cDNA序列，并根据目的基因全长cDNA序列设计如下构树基因A的特异引物：

引物1：5′-ATCATCACTTCACTGTTTCAGCTCCAACTAAC-3′，

引物2：5′-TTCATTCCCACATATACCATAGTCACCA-3′。

以上述步骤2合成的第一链cDNA为模板，用引物1和引物2进行PCR扩增。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。其中，泳道M为TRANS2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物。结果表明，经PCR扩增获得了目的基因的特异性扩增的片段。回收并纯化该产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。测序结果表明，该PCR扩增产物与上述拼接得到的序列在扩增部分完全相同，为目的基因的序列。