针对磷酸化TAU蛋白的骆驼科单结构域抗体以及生产其缀合物的方法与流程

技术特征：

1.一种分离的骆驼科重链抗体的可变结构域(VHH)，其特征在于其针对磷酸化tau蛋白，并且通过使用衍生自tau蛋白C端的序列是CSIDMVDS(PO₃H₂)PQLATLAD(SEQ ID NO.6)的单磷酸化肽、或人阿尔茨海默氏病脑提取物富含的磷酸化tau免疫骆驼科获得。

2.根据权利要求1所述的VHH，其特征在于，VHH结合磷酸化tau蛋白的磷酸化丝氨酸422。

3.根据权利要求1或2所述的VHH，其特征在于，方法包括以下步骤：

a)使用衍生自tau蛋白C端的序列是CSIDMVDS(PO₃H₂)PQLATLAD(SEQ ID NO.6)的单磷酸化肽、或人阿尔茨海默氏病脑提取物富含的磷酸化tau免疫骆驼科，优选羊驼Lama pacos，

b)分离经免疫的骆驼科的外周淋巴细胞，获得总RNA并合成相应的cDNA，

c)构建编码VHH的cDNA片段的文库，

d)使用PCR将在步骤c)中获得的编码VHH的cDNA转录为mRNA，将mRNA转换为核糖体展示形式，并且通过核糖体展示选择VHH，以及

e)载体中表达VHH结构域。

4.根据权利要求1至3任一项所述的VHH，其特征在于，所述骆驼科是羊驼Lama pacos。

5.根据权利要求1至4任一项所述的VHH，其特征在于，其氨基酸序列从N端至C端包含氨基酸序列SEQ ID NO.1、氨基酸序列SEQ ID NO.2和氨基酸序列SEQ ID NO.3。

6.根据权利要求5所述的VHH，其特征在于，其由氨基酸序列SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5组成。

7.一种SEQ ID NO.5所示的VHH的分离的变体，其中所述VHH变体针对磷酸化tau蛋白的磷酸化丝氨酸422，并且其中所述变体的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO.5具有至少95％的同一性。

8.根据权利要求7所述的分离的变体，其特征在于，其氨基酸序列从N端至C端包括氨基酸序列SEQ ID NO.1、氨基酸序列SEQ ID NO.2和氨基酸序列SEQ ID NO.3。

9.根据权利要求7所述的分离的变体，其特征在于，其具有含有以下突变的氨基酸序列SEQ ID NO.5：

-在氨基酸序列SEQ ID NO.5的位置3的谷氨酰胺残基(Gln，Q)被选自以下的氨基酸残基取代：天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)，优选Glu，

-在氨基酸序列SEQ ID NO.5的位置52的异亮氨酸残基(Ile，I)被选自以下的氨基酸残基取代：丙氨酸(Ala，A)、甘氨酸(Gly，G)，以及优选Gly，

-在氨基酸序列SEQ ID NO.5的位置86的缬氨酸残基(Val，V)被选自以下的氨基酸残基取代：丙氨酸(Ala，A)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酰胺(Gln，Q)、天冬氨酸(Asp，D)、谷氨酸(Glu，E)、赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)和甘氨酸(Gly，G)，优选Gly，

-以及，任选地，在氨基酸序列SEQ ID NO.5的N端位置添加两个氨基酸残基，并且选自：二肽谷氨酸-缬氨酸(E-V)和天冬氨酸-缬氨酸(D-V)，优选D-V。

10.根据权利要求7所述的分离的VHH变体，其特征在于，其由氨基酸序列SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16组成。

11.一种VHH衍生物，其由包含根据权利要求1至6任一项所述的VHH、或者根据权利要求7至10任一项所述的VHH变体的多肽组成，所述多肽包含的所述VHH或VHH变体能够结合磷酸化tau蛋白。

12.根据权利要求11所述的VHH衍生物，其特征在于，其具有式P-C-Z或者Z-C-P，其中：

P是100至500个氨基酸的肽，其包含或由根据权利要求1至6任一项所述的VHH、或根据权利要求7至10任一项所述的VHH变体组成，其中所述氨基酸序列不含有可接触的还原的半胱氨酸残基，并且优选不含还原的半胱氨酸残基，

C是半胱氨酸残基，

Z代表1至10个氨基酸的间隔序列，优选1至10个中性的或带负电的氨基酸的间隔序列，其中Z的氨基酸残基是相同的或不同的，并且其中Z不含半胱氨酸残基。

13.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至6任一项所述的VHH、或权利要求7至10任一项所述的VHH变体、或权利要求11或12任一项所述的VHH衍生物。

14.一种重组表达盒，其包含在转录启动子控制下的权利要求13所述的多核苷酸，所述转录启动子允许在宿主细胞中调节所述多核苷酸的转录。

15.一种重组载体，其包含权利要求13所述的多核苷酸或权利要求14所述的重组表达盒。

16.一种宿主细胞，其含有权利要求14所述的重组表达盒或权利要求15所述的重组载体。

17.一种诊断或者治疗剂，其包含直接或者间接、共价或非共价连接至感兴趣物质的如权利要求1至6任一项所述的VHH、或如权利要求7至10任一项所述的VHH变体、或如权利要求11或12任一项所述的VHH衍生物。

18.根据权利要求17所述的诊断或者治疗剂，其特征在于，所述VHH衍生物是权利要求12所限定的，并且其中所述VHH衍生物的半胱氨酸残基C通过硫醚键连接至感兴趣物质。

19.根据权利要求18所述的诊断或者治疗剂，其特征在于，所述半胱氨酸残基C通过带有感兴趣物质的巯基反应性化合物连接至所述感兴趣物质。

20.根据权利要求19所述的诊断或者治疗剂，其特征在于，所述巯基反应性化合物是马来酰亚胺化合物。

21.根据权利要求17至20任一项所述的治疗剂，其特征在于，所述感兴趣物质选自肽、酶、核酸、病毒和化学化合物。

22.根据权利要求17至21任一项所述的治疗剂，其特征在于，治疗化合物选自止痛化合物、抗炎化合物、抗抑郁化合物、细胞毒性化合物、抗惊厥化合物或者抗神经退行性化合物。

23.根据权利要求17至20任一项所述的诊断剂，其特征在于，诊断化合物选自酶、荧光团、NMR或MRI造影剂、放射性同位素、或纳米颗粒。

24.根据权利要求23所述的诊断剂，其特征在于，所述诊断化合物是NMR或MRI造影剂，所述NMR或MRI造影剂选自顺磁剂钆(Gd)、镝(Dy)和锰(Mn)，以及基于铁氧化物或者铂铁的超顺磁剂，以及X-核，比如¹⁸F、¹³C、²³Na、¹⁷O、¹⁵N，优选钆。

25.根据权利要求23所述的诊断剂，其特征在于，所述诊断化合物是荧光团，所述荧光团选自绿色荧光蛋白(GFP)、在光谱紫外(UV)部分的波长处激发的蓝色荧光染料、AMCA(7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸)、Alexa350、在蓝光处激发的绿色荧光染料、FITC、Cy2、Alexa488、在绿光处激发的红色荧光染料、罗丹明、德克萨斯红、Cy3、Alexa染料546、564和594、远红光激发的染料和Cy5，优选Alexa488。

26.根据权利要求17所述的诊断或者治疗剂，其特征在于，所述感兴趣物质是脂质体或者聚合实体，其包含如权利要求21至25任一项所限定的诊断或者治疗化合物。

27.一种非位点特异性方法，其用于将如权利要求1至6任一项所述的VHH、或如权利要求7至10任一项所述的VHH变体、或如权利要求11或12任一项所述的VHH衍生物和感兴趣物质偶联，所述方法包括将感兴趣物质和如权利要求1至6任一项所述的VHH、或如权利要求7至10任一项所述的VHH变体、或如权利要求11或12任一项所述的VHH衍生物进行缀合的步骤。

28.一种位点特异性方法，其用于将如权利要求12的VHH衍生物和感兴趣物质偶联，包含所述VHH衍生物和带有巯基反应性官能团的感兴趣物质的缀合步骤。

29.一种试剂盒，其用于脑成像、或者用于诊断或者监测神经纤维缠结、神经纤维网细丝或营养不良的神经突起所介导的疾病，如tau蛋白病，包括阿尔茨海默氏病(AD)、皮克病(PD)、额颞痴呆症(FTD)、皮质基底核退化(CBD)和进行性核上性麻痹(PSP)，所述试剂盒包含至少如权利要求1至6任一项所述的VHH、或如权利要求7至10任一项所述的VHH变体、或如权利要求11或12任一项所述的VHH衍生物和诊断剂，以及任选地诊断剂、或如权利要求17至18和21至24任一项所述的诊断剂和诊断剂。

30.权利要求17-20和23-26任一项所述的诊断剂的用途，其用于在受试者中诊断或者监测神经纤维缠结、神经纤维网细丝或营养不良的神经突起所介导的疾病，如tau蛋白病，包括阿尔茨海默氏病(AD)、皮克病(PD)、额颞痴呆症(FTD)、皮质基底核退化(CBD)和进行性核上性麻痹(PSP)。

31.一种用于在受试者中体外或者离体诊断或监测神经纤维缠结、神经纤维网细丝或营养不良的神经突起介导的疾病的方法，所述疾病如tau蛋白病，包括阿尔茨海默氏病(AD)、皮克病(PD)、额颞痴呆症(FTD)、皮质基底核退化(CBD)和进行性核上性麻痹(PSP)，包括步骤：

a)用如权利要求17-20和23-26任一项所述的诊断剂体外接触来自所述受试者的适当生物样本，以及

b)在所述生物样本中，确定磷酸化tau蛋白的存在或者不存在，

所述磷酸化tau蛋白的存在表明所述受试者患有神经纤维缠结、神经纤维网细丝或营养不良的神经突起介导的疾病，如tau蛋白病，包括阿尔茨海默氏病(AD)、皮克病(PD)、额颞痴呆症(FTD)、皮质基底核退化(CBD)和进行性核上性麻痹(PSP)。

32.一种用于在受试者中体外或者离体监测神经纤维缠结、神经纤维网细丝或营养不良的神经突起介导的疾病的进展或消退的方法，所述疾病如tau蛋白病，包括阿尔茨海默氏病(AD)、皮克病(PD)、额颞痴呆症(FTD)、皮质基底核退化(CBD)和进行性核上性麻痹(PSP)，包括步骤：

a)用如权利要求17-20和23-26任一项所述的诊断剂体外接触来自所述受试者的适当生物样本，

b)在所述生物样本中，确定磷酸化tau蛋白的量，以及

c)将步骤b)确定的量和所述受试者先前获得的磷酸化tau蛋白的量进行比较，

磷酸化tau蛋白的量显著增加，构成了神经纤维缠结、神经纤维网细丝或营养不良的神经突起介导的所述疾病的进展的标志，磷酸化tau蛋白的显著降低构成了神经纤维缠结、神经纤维网细丝或营养不良的神经突起介导的所述疾病的消退的标志。

33.一种在受试者体内成像神经纤维缠结、神经纤维网细丝或营养不良的神经突起的方法，包括步骤：

a)在受试者中施用可检出量的如权利要求17-20和23-26任一项所述的诊断剂，所述受试者优选是人，以及

b)通过成像方法，检测所述受试者中的诊断剂。

34.一种药物组合物，其包含如权利要求17-22和26任一项所述的治疗剂和药学上可接受的载体。

35.一种获得针对磷酸化tau蛋白的VHH的方法，其包含使用衍生自tau蛋白C端的序列是CSIDMVDS(PO₃H₂)PQLATLAD(SEQ ID NO.6)的单磷酸化肽、或人阿尔茨海默氏病脑提取物中富含的磷酸化tau免疫骆驼科的步骤。