本发明涉及生物工程，尤其是涉及一种匹马霉素B菌株的基因工程改造方法。
背景技术：
匹马霉素是一种常用的多烯类抗生素，其结构简单、化学性质稳定，被广泛用作食品防腐添加剂、抗真菌兽药以及用于角膜炎治疗。在目前最常用的四种多烯类抗生素(匹马霉素、两性霉素B、制霉菌素和杀念菌素)中，匹马霉素的溶血毒性最低。但匹马霉素的毒性依旧是限制其临床应用的重要原因。因此，通过基因工程改造或化学衍生的方法进一步降低匹马霉素的溶血毒性，将极大地促进匹马霉素的临床应用。在前期的研究中，我们通过基因工程改造的方法，对匹马霉素生物合成基因簇中的P450单加氧酶基因pimG进行了失活，并成功从其发酵产物中鉴定得到了一种低毒的匹马霉素衍生物—匹马霉素B(4,5-脱环氧-12-脱羧-12甲基-匹马霉素)。经体外活性实验测定，匹马霉素B的活性与匹马霉素相似，而其毒性却极大的降低，因此，匹马霉素B是一种非常安全的低毒匹马霉素衍生物，具有良好的应用前景。
但是，P450单加氧酶基因pimG失活菌株QZ01除产生匹马霉素B外，还产生另一高活性的匹马霉素A(12-脱羧-12甲基-匹马霉素)及无活性的匹马霉素C(2-氢-3-羟基-4,5-脱环氧-12-脱羧-12甲基-匹马霉素)。菌株QZ01发酵产物的复杂性大大增加了后续分离纯化的难度，而其较低的产量也限制了匹马霉素B的工业化生产。因此，通过基因工程改造的方法，消除菌株QZ01中匹马霉素A及无活性匹马霉素C的产生，并进一步提高匹马霉素B的产量，将极大地推动匹马霉素B的工业化生产，具有重要的经济价值。体内及体外实验证实，匹马霉素A是匹马霉素B在P450单加氧酶PimD的催化下发生C4-C5位环氧化转化而来，而匹马霉素C的产生则是由PKS基因中DH12结构域的活性不完全造成的。因此，我们在QZ01菌株中尝试通过以完全活性的DH11KR11结构域替换DH12KR12结构域并缺失基因pimD，消除匹马霉素A及C的产生，并提高匹马霉素B的产量，进而达到优化产生菌株的目的。
技术实现要素：
本发明的目的，就是为了提高匹马霉素B的产量，提供一种匹马霉素B菌株的基因工程改造方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种匹马霉素B菌株的基因工程改造方法，是通过在菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01中以PKS基因中的DH11KR11结构域替换DH12KR12结构域并缺失后修饰基因pimD，实现匹马霉素B产量的大幅度提高，并完全消除了匹马霉素A与匹马霉素C的产生。
所述DH11KR11结构域来源于PKS基因pimS3，DH11KR11结构域的序列如SEQ ID NO.1所示。
所述DH12KR12结构域来源于PKS基因pimS4，PKS基因pimS4的序列如SEQ ID NO.2所示，其中DH12KR12结构域的范围为2713bp至4614bp。
所述pimD为P450单加氧酶基因，负责编码催化匹马霉素B到匹马霉素A的转化，pimD基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
所述以PKS基因中的DH11KR11结构域替换DH12KR12结构域并缺失后修饰基因pimD的构建步骤如下：
一、设计并构建用于DH12KR12结构域替换的质粒I；
二、在菌株QZ01的基础上同框敲除PKS基因pimS4得到受体菌株QZ11；
三、将步骤一构建得到的质粒I接合转移导入受体菌株QZ11中，筛选得到DH12KR12结构域替换菌株QZ12；
四、在菌株QZ12的基础上同框敲除后修饰基因pimD，得到DH12KR12结构域替换及基因pimD缺失菌株QZ13。
步骤一中所述质粒I的构建方法是，在质粒pIB139的NdeI/XbaI位点插入6.1kb测序确认的DH12KR12结构域已被替换为DH11KR11结构域的基因pimS4的PCR片段。
步骤二中所述受体菌株QZ11的构建方法是，首先构建PKS基因pimS4的同框缺失质粒，并通过接合转移同框缺失菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01中的基因pimS4，得到受体菌株QZ11。
步骤四中所述基因pimD缺失菌株QZ13的构建方法是，首先构建后修饰基因pimD的同框缺失质粒，并通过接合转移同框缺失菌株QZ12中的后修饰基因pimD，得到DH12KR12结构域替换及基因pimD缺失菌株QZ13。
采用本发明的方法，可以解除PKS中DH12KR12结构域活性偏低的限制，从而消除匹马霉素C的产生，并缺失后修饰基因pimD，从而阻断匹马霉素B到匹马霉素A的转化，消除匹马霉素A的产生，最终使匹马霉素B的产量提高了约11倍，实验室摇瓶发酵水平达到805mg/L，极大推动了匹马霉素B的工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，并给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或制造厂商的建议条件。
实施例
步骤一：整合型质粒I的构建
以菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01的基因组DNA为模板，使用引物KSAT12-F/R、DHKR11-F/R、ACP12TE-F/R，通过PCR扩增得到替换后PKS基因pimS4的三个片段KSAT12、DHKR11、ACP12TE，通过基因测序确认PCR片段的正确性。在质粒pIB139的NdeI/XbaI位点同时插入测序正确的KSAT12、DHKR11与ACP12TE基因片段(NdeI/XbaI酶切位点)；通过上述方法得到用于DH12KR12结构域置换的质粒I。
上述步骤一中所用到的引物序列如表1所示：
表1
步骤二：在菌株QZ01的基础上敲除PKS基因pimS4得到受体菌株QZ11。
以菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01的基因组DNA为模板，使用引物pimS4-L-F/R及pimS4-R-F/R，通过PCR扩增得到敲除PKS基因pimS4所需的同源臂pimS4-L(HindIII/XbaI酶切位点)及pimS4-R(HindIII/KpnI酶切位点)。测序确认后，左右同源臂连接至经KpnI/XbaI处理的质粒pJTU1278，获得基因pimS4缺失质粒。通过接合转移进一步将基因pimS4缺失质粒转入菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01中，获得接合子，经进一步的无抗松弛及PCR验证后，即获得受体菌株QZ11。
上述步骤二中所用到的引物序列如表2所示：
表2
步骤三：将整合型质粒I通过接合转移的策略导入菌株QZ11，并筛选得到DH12KR12结构域替换菌株QZ12。
将已构建完成用于基因过表达的质粒I转化进入大肠杆菌宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取该转化子于含有氯霉素、卡那霉素和阿泊拉霉素三种抗生素的LB中于37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按10％的比例转接一次并培养4h，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。于此同时制备菌株QZ01的新鲜孢子约109个，用TES溶液漂洗2～3次之后再用2mLTES溶液悬浮孢子，于50℃热激10min后，冷却至室温，等体积加入2×孢子预萌发培养液后于37℃培养2.5h，并用新鲜的LB溶液漂洗孢子2～3次。将预萌发的孢子与之前制备的大肠杆菌宿主菌E.coli ET12567混合(孢子和宿主菌的比例约为10:1)均匀后涂布于YMG平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱正置培养17h后取出平板，分别取阿泊拉霉素和萘啶酮酸两种抗生素混匀于1mL无菌水中，覆盖于YMG平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中培养。一般3～5天后可见平板上有单菌落接合子长出，通过菌丝体PCR验证和抗性验证的方法验证接合子正确，即得到DH12KR12结构域替换菌株QZ12。
步骤四：在菌株QZ12的基础上敲除基因pimD得到改造菌株QZ13。
以菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01的基因组DNA为模板，使用引物pimD-L-F/R及pimD-R-F/R，通过PCR扩增得到敲除基因pimD所需的同源臂pimD-L(HindIII/XbaI酶切位点)及pimD-R(HindIII/KpnI酶切位点)。测序确认后，左右同源臂连接至经KpnI/XbaI处理的质粒pJTU1278，获得基因pimD缺失质粒。通过接合转移进一步将基因pimD缺失质粒转入菌株QZ12中，获得接合子，经进一步的无抗松弛及PCR验证后，即获得改造菌株QZ13。
上述步骤四中所用到的引物序列如表3所示：
表3
步骤五：改造菌株QZ13的发酵培养及其产量测定
种子培养基各组分质量体积比为葡萄糖1.75％、胰蛋白胨1.5％、氯化钠1.0％；发酵培养基各组分质量体积比为葡萄糖6.0％、酵母提取物0.7％、黄豆饼粉2.8％。按种子培养基及发酵培养配方，分别配制种子培养基及发酵培养基，并分装于250mL三棱瓶中，每瓶装50mL，115℃灭菌30min，将过表达菌株及对照菌株菌丝体接入上述种子培养基中，以220rpm转速、30℃下、摇床培养24h得种子培养液。将种子培养液按10％接种量接入发酵培养基中，以220rpm转速、30℃下，摇床培养5d。
使用Agilent公司的Agilent 1200系列HPLC进行色谱分析，采用DAD二极管阵列检测器测定303nm下的色谱吸收峰。色谱柱的参数为：Agilent TC-C18，5μm，4.6×250mm；流动相流速为1mL/min；流动相组成及其体积比为：67％的含0.1％甲酸(v/v)的水溶液和33％的HPLC级乙腈。柱温：35℃。
表4为出发菌株QZ01与改造菌株QZ13的发酵产量数据，结果表明，改造菌株QZ13不再产生匹马霉素A及无活性匹马霉素C，并且低毒匹马霉素B的产量提高了约11倍，达到805mg/L，为匹马霉素B的工业化生产奠定了基础。
表4：出发菌株QZ01与改造菌株QZ13的发酵产量数据
—表示该菌株不产生这一类抗生素。