本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种二肽酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术：
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有机磷化合物属于磷酸酯或磷酸硫醇类衍生物。世界首例有机磷化合物四乙基焦磷酸酯于1937年被人工合成，二战期间沙林、索曼等有机磷化合物曾被用作化学武器，而在现代有机磷被作为农药、石油添加剂、增塑剂、阻燃剂等在工农业中广泛使用。以农药为例，目前有机磷类农药有100余种，占世界农药总使用量的38％。我国是农药生产和使用大国，2015年化学农药原药年产量达374万吨，其中有机磷农药占近一半，我国有机磷类农药使用量约每年8万吨。有机磷化合物能与乙酰胆碱酯酶等受体蛋白丝氨酸特异结合，对高等动物具有强神经毒性。人类活动持续过度使用的有机磷化合物经地表径流和土壤渗漏进入江河，最终汇入海洋，可显著影响微藻、甲壳类动物、棘皮动物和鱼类的生长发育。有机磷污染已成为全球性环境问题，有机磷化合物残留在土壤、河流、江河入海口、近岸海洋等区域被广泛检测到，并对人类健康造成威胁，据估计每年有近300万起因摄入有机磷化合物引发的中毒事件。
微生物彻底矿化有机磷化合物转变为能量需经历水解、氧化等多步反应，其中对磷氧烷基或磷氧芳基酯键的水解是有机磷化合物解毒最为关键的一步，而此步反应由微生物体内的有机磷水解酶催化。有机磷水解酶，亦称磷酸三酯酶(EC 3.1.8)，该类酶包含两个亚类：一是芳二烷基磷酸酯酶(EC 3.1.8.1)，倾向水解含P-O的有机磷酸三酯类化合物；另一类是二异丙基氟磷酸水解酶(EC 3.1.8.2)，倾向水解含P-F或P-CN键的有机磷酸酯类化合物。目前研究较多的微生物有机磷水解酶主要包括三类：有机磷水解酶(organophosphorus hydrolase，OPH)、甲基对硫磷水解酶(methyl parathion hydrolase，MPH)和有机磷酸酐酶(organophosphorous acid anhydrolase，OPAA)。OPH，MPH和OPAA在结构上无相似性，但都是二价金属酶，依靠金属离子去质子化水分子实现对磷酸酯键的攻击。有机磷水解酶降解有机磷类异型生物质的活性均来自具有其他功能的常见蛋白结构域。OPH属于氨基水解酶超家族，具有典型的(α/β)8桶结构；MPH属于β-内酰胺酶超家族，能高效水解甲基对硫磷，该类酶仅在中国发现；OPAA来源于肽酶M24B家族，该家族蛋白羧基端都由保守的皮塔饼结构构成。OPH和MPH都能水解信号分子高丝氨酸内酯，内酯酶活性是对氧磷酶活性的102-106倍，提示这两类有机磷水解酶由细菌群感效应调节蛋白进化而来。已鉴定的OPAA一级结构与脯氨酸二肽酶高度同源，这类肽酶在细菌体内参与胶原蛋白利用过程，介导脯氨酸的释放，为微生物体提供营养，而有机磷水解酶是其混杂活性，通常对含有P＝S键的有机磷类化合物催化活力极微弱，利用蛋白质工程技术改良这类肽酶可增强该酶水解有机磷化合物的能力，使其成为有机磷类污染物修复工具酶源。
技术实现要素：
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本发明针对现有技术中二肽酶OPAA4301对有机磷化合物水解活力较弱的不足，提供了一类水解有机磷化合物活性提高的二肽酶突变体及其编码基因和应用。
发明人从分离自南海沉积物(18°0’N，109°42′E，-63m水深)的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)SCSIO 04301中鉴定一条编码假定二肽酶OPAA4301(Genbank accession NO.WP_036973676)的基因opaa4301(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，对应的氨基酸序列(如SEQ ID NO.1所示)与大肠杆菌来源的M24家族脯氨酸二肽酶PepQ(PDB code:4QR8)的氨基酸一致性达51％，体外活性表征表明该基因合成的二肽酶OPAA4301同时具有水解对氧磷(kcat/Km＝(0.935±0.089)×103M-1s-1)和二肽底物Gly-Pro(kcat/Km＝(7.684±1.242)×104M-1s-1)活性，催化二肽底物的能力是对氧磷的近100倍。与此同时对含有P＝S键的有机磷类化合物催化活力极微弱(kcat/Km＝1.24±0.01M-1s-1)。
本发明针对现有技术中二肽酶OPAA4301对有机磷化合物水解活力较弱的不足，利用基因突变技术改造二肽酶OPAA4301以提高其水解有机磷化合物的活性，进而提供了系列水解对氧磷和甲基对硫磷活性提高的二肽酶突变体及其编码基因，含有二肽酶突变体编码基因的重组表达载体和含有该重组表达载体的重组菌及其制备方法，以及二肽酶突变体在水解有机磷化合物及修复有机磷化合物污染中的应用。
二肽酶OPAA4301的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该二肽酶OPAA4301同时具有二肽酶和有机磷水解酶活性，对有机磷农药对氧磷和甲基对硫磷的催化速率常数(kcat/Km)分别为(0.935±0.089)×103M-1s-1和1.24±0.01M-1s-1。为提高二肽酶OPAA4301对对氧磷和甲基对硫磷的水解活性，发明人通过对其底物结合相关的区域(小底物结合口袋、大底物结合口袋和离去结合位点)氨基酸进行蛋白质工程改造技术，分别以上述两种农药为底物从突变文库中筛选有益突变体，并对有益突变进行组合。
本发明的第一个目的是提供一类水解有机磷化合物活性提高的二肽酶突变体，其特征在于，其为二肽酶突变体D45W、H226G、Y292F/L366F、D45W/H226G、D45W/Y292F/L366F、D45W/H226G/Y292F/L366F、H343I、L225Y/H226L或L225Y/H226L/H343I；
所述的二肽酶突变体D45W，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；
所述的二肽酶突变体H226G，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第226位组氨酸替换为甘氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；
所述的二肽酶突变体Y292F/L366F，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第292位酪氨酸和第366位亮氨酸同时替换为苯丙氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；
所述的二肽酶突变体D45W/H226G，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第226位组氨酸替换为甘氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；
所述的二肽酶突变体D45W/Y292F/L366F，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第292位酪氨酸替换为苯丙氨酸，同时第366位亮氨酸替换为苯丙氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；
所述的二肽酶突变体D45W/H226G/Y292F/L366F，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第226位组氨酸替换为甘氨酸，同时第292位酪氨酸替换为苯丙氨酸，同时第366位亮氨酸替换为苯丙氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；
所述的二肽酶突变体H343I，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第343位组氨酸替换为异亮氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；
所述的二肽酶突变体L225Y/H226L，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第225位亮氨酸替换为酪氨酸，同时第226位组氨酸替换为亮氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；
所述的二肽酶突变体L225Y/H226L/H343I，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第225位亮氨酸替换为酪氨酸，同时第226位组氨酸替换为亮氨酸，同时第343为组氨酸替换为异亮氨酸，其它与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同。
所述的二肽酶突变体水解对氧磷活力较佳的情况是：对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第45、226、292、366位氨基酸残基中的一个或者多个位点进行氨基酸替换后形成的新的氨基酸序列对应的二肽酶突变体。所述的二肽酶突变体水解甲基对硫磷活力较佳的情况是：对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第225、226、342、343位氨基酸残基中的一个或者多个位点进行氨基酸替换后形成的新的氨基酸序列对应的二肽酶突变体。
所述的二肽酶突变体水解对氧磷活力最佳的情况是：同时对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的二肽酶的第45、226位氨基酸残基经过氨基酸替换的新氨基酸序列对应的二肽酶突变体D45W/H226G。所述的二肽酶突变体水解甲基对硫磷活力最佳的情况是：同时对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的二肽酶的第225、226、343位氨基酸残基经过氨基酸替换的新氨基酸序列对应的二肽酶突变体L225Y/H226L/H343I。
所述的二肽酶突变体的制备可以是从表达该蛋白的重组菌中分离获得，也可以是人工合成获得。
本发明的第二个目的是提供上述二肽酶突变体的编码基因。
编码基因可以从含二肽酶突变体的编码基因的重组表达质粒或重组转化体中分离获得，也可以通过人工全基因序列合成获得。由于密码子存在简并性，本发明所述的编码基因不限于一种，还可适当引入替换以提供多聚核苷酸的同系物。本发明的多聚核苷酸同系物可通过维持上述二肽酶突变体的氨基酸序列的基础上对基因片段中的一个或多个碱基进行替换制得。
本发明的第三个目的是提供含有上述二肽酶突变体的编码基因的重组表达载体。
所述的重组表达载体的制备方法为将编码本发明所述的二肽酶突变体的编码基因连接于各种异源表达载体上构建而成。所述的异源表达载体可为本领域常规各类质粒。
本发明的第四个目的是提供含有上述重组表达载体的重组菌。
所述的重组菌可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规宿主细胞，可供实现重组表达载体稳定自主复制，且所携带的本发明提供的编码基因可被有效表达。所述的转化方法为本领域常规方法，如热激法、原生质体融合法、电转化法。重组菌用于制备二肽酶突变体。
本发明的第五个目的是提供上述二肽酶突变体在水解有机磷化合物中的应用。
上述的二肽酶突变体D45W、H226G、Y292F/L366F、D45W/H226G、D45W/Y292F/L366F、D45W/H226G/Y292F/L366F在水解对氧磷中的应用。
上述的二肽酶突变体H343I、L225Y/H226L、L225Y/H226L/H343I在水解甲基对硫磷中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述二肽酶突变体在有机磷化合物污染修复中的应用。
上述的二肽酶突变体D45W、H226G、Y292F/L366F、D45W/H226G、D45W/Y292F/L366F、D45W/H226G/Y292F/L366F在对氧磷污染修复中的应用。
上述的二肽酶突变体H343I、L225Y/H226L、L225Y/H226L/H343I在甲基对硫磷污染修复中的应用。
与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：针对海洋细菌二肽酶OPPA4301水解有机磷化合物混杂活性低的问题，以二肽酶OPAA4301作为蛋白质工程改造的起点，通过对底物结合区域氨基酸残基的进化与筛选，并组合有益突变，获得分别水解对氧磷和甲基对硫磷活性大幅提高的一系列二肽酶突变体。二肽酶突变体D45W、H226G、Y292F/L366F、D45W/H226G、D45W/Y292F/L366F、D45W/H226G/Y292F/L366F，相较于野生型二肽酶OPAA4301，水解对氧磷的催化速率常数kcat/Km均显著提高，H343I、L225Y/H226L、L225Y/H226L/H343I，相较于野生型二肽酶OPAA4301，水解甲基对硫磷的催化速率常数kcat/Km均显著提高。水解对氧磷最优二肽酶突变体D45W/H226G的催化速率常数kcat/Km为(2.96±0.05)×104M-1s-1，相较于野生型二肽酶OPAA4301提高了30.68倍；水解甲基对硫磷最优二肽酶突变体L225Y/H226L/H343I的催化速率常数kcat/Km为(1.10±0.02)×104M-1s-1，相较于野生型二肽酶OPAA4301提高了8837.71倍。本发明的二肽酶突变体可高效水解对氧磷、甲基对硫磷等常见有机磷化合物污染物，在有机磷化合物污染修复领域具有良好应用前景。
附图说明：
图1是二肽酶突变体D45W/H226G和L225Y/H226L/H343I水解有机磷化合物的催化动力学参数。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所用的方法，如无特殊说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。高保真DNA聚合酶Fast Pfu Taq Mix购自北京全式金生物技术有限公司，内切酶购自Fermentas公司，对氧磷和甲基对硫磷购自Sigma。其他化学试剂一般为国产分析纯。
实施例1：
单位点饱和突变体文库的构建
海洋沉积物来源的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)SCSIO 04301中的二肽酶OPAA4301具有较强的肽酶活性和较弱的有机磷水解酶活性，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过同源建模与结构比对发现该二肽酶OPAA4301存在三个典型与底物结合相关的区域：小底物结合口袋(由第45位天冬氨酸、第212位酪氨酸、第342位缬氨酸、第343位组氨酸组成)、大底物结合口袋(由第89位色氨酸、第225位亮氨酸、第226位组氨酸、第332位组氨酸、第418位精氨酸组成)、离去结合位点(由第292位酪氨酸和第366位亮氨酸组成)。本发明通过对底物结合区域氨基酸(第45位天冬氨酸、第212位酪氨酸、第342位缬氨酸、第343位组氨酸、第89位色氨酸、第225位亮氨酸、第226位组氨酸、第332位组氨酸、第418位精氨酸、第292位酪氨酸、第366位亮氨酸)的进化，实现二肽酶水解有机磷化合物的能力大幅提高。根据海洋沉积物来源的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)SCSIO 04301中的二肽酶OPAA4301的基因opaa4301，设计对二肽酶OPAA4301的第45位天冬氨酸、第212位酪氨酸、第342位缬氨酸、第343位组氨酸、第89位色氨酸、第225位亮氨酸、第226位组氨酸、第332位组氨酸、第418位精氨酸、第292位酪氨酸、第366位亮氨酸进行单位点氨基酸替换的定点饱和突变引物，其引物设计如表1所示。
表1定点饱和突变引物列表(N为A、G、C或T；K为G或T)
基因点突变采用反向PCR法，以连接有二肽酶OPAA4301编码基因opaa4301(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的大肠杆菌表达载体pET22b-opaa4301为模板，以一对定点饱和突变引物进行反向PCR扩增，获得线性化表达载体核酸片段。PCR扩增使用的DNA聚合酶为北京全式金生物技术有限公司的Fast Pfu mix；反应程序为：95℃5min；95℃30sec，50℃30sec，72℃3min，共30个循环；72℃10min。反应结束后，用DpnⅠ消化甲基化模板，纯化消化产物直接转化至大肠杆菌XL1-Blue中，将转化后的大肠杆菌涂布于50μg/mL氨苄青霉素的LA抗性平板上，37℃培养12小时。用灭菌PBS缓冲液将不少于1000个克隆的转化子重悬并收集菌体，提取质粒后转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)，涂布于50μg/mL氨苄青霉素的LA抗性平板，37℃培养12小时，得到饱和突变文库平板。平板上生长的菌落即为二肽酶OPAA4301底物结合相关位点氨基酸替换的二肽酶突变体转化子。
实施例2:
突变文库中水解有机磷化合物活性提高的二肽酶突变体筛选
挑取实施例1产生的饱和突变文库平板上的二肽酶突变体转化子单菌落至装有200μL含0.1mM IPTG和50μg/ml氨苄青霉素LB液体培养基的96孔酶标板孔内，从每个底物结合相关位点氨基酸的饱和突变文库中至少挑取384个单克隆。28℃，100r/min摇床培养60小时。静置30min后吸取上清，分别以对氧磷和甲基对硫磷为底物，55℃反应30min酶标仪读取反应液405nm吸光值的变化。吸光值高于野生型二肽酶OPAA4301的为潜在活性提高的突变克隆，送交上海美技生物技术有限公司进行质粒常规测序以排除重复或沉默突变。提取测序验证的突变质粒并转化至大肠杆菌表达宿主Rosetta(DE3)中，进行扩大发酵制备纯化二肽酶突变体。
将上述二肽酶突变体转化子接种于含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养12小时，从培养后的菌液中吸取1mL菌液，加入到100mL新鲜LB液体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)的250mL三角瓶中；37℃，200r/min摇床中剧烈振荡培养2～3h，检测OD值，当OD600达到0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，在28℃，180rpm摇床中继续振荡培养约12h。将诱导好的菌液于4℃，6000rpm条件下离心10min，收集菌体；将收集的菌体用50mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液重悬，用超声波进行细胞破碎。超声波工作条件为：功率30％，工作5s暂停5s，破碎时间为30min；在4℃，12000rpm下离心30min，收集上清溶液，即为粗酶液可用于镍柱纯化。纯化过程：5mL蒸馏水冲洗镍柱→5mL Binding缓冲液(5mmol/L咪唑，50mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液)平衡→加入过滤好的粗酶液→20mL Binding buffer(5mmol/L咪唑，50mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液)冲洗层析柱→100～200mL Washing buffer(20mmol/L咪唑，50mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液)冲洗层析柱→10mL Elution buffer(500mmol/L咪唑，50mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液)洗脱，收集洗脱液进行SDS-PAGE检测纯化效果，由此得到二肽酶突变体纯酶液。
以纯酶的比活力为指标，分别以对氧磷和甲基对硫磷为底物，进一步比较野生型二肽酶OPAA4301与单位点二肽酶突变体催化活性的差异。酶活测定反应体系包括1mM底物，0.4μM纯化酶蛋白，200μM氯化锰，50mM甘氨酸-氢氧化钠(pH8.5)，于55℃反应30min，95℃加热5min终止反应，酶标仪测定405nm处吸光值。对照对硝基苯酚在405nm吸光值的标准曲线换算反应产生的对硝基苯酚产物量。比活力表示为每毫克酶蛋白每分钟催化产生的产物对硝基苯酚量。获得水解对氧磷活性提高的二肽酶突变体列于表2，水解甲基对硫磷活性提高的二肽酶突变体列于表3。
表2水解对氧磷活性提高的单位点突变体
表3水解甲基对硫磷活性提高的单位点突变体
表2和表3中的WT是野生型二肽酶OPAA4301，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；D45W的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第45位天冬氨酸替换为色氨酸；H226G的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第226位组氨酸替换为甘氨酸；H332P的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第332位组氨酸替换为脯氨酸；Y292F的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第292位酪氨酸替换为苯丙氨酸；L366F的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第366位亮氨酸替换为苯丙氨酸。
实施例3：
多位点组合突变进一步提高二肽酶突变体水解有机磷化合物活性
将获得的单位点二肽酶突变体按次序进行同区域内组合突变和不同区域组合突变，同时对一级结构邻近的两对氨基酸第225、226位和第342、343位进行组合饱和突变(Combinatorial Saturation Test)。按照实施例1的突变方法，以含有表2、表3所述的水解有机磷化合物活性提高的单位点突变体的编码基因的重组表达载体为模板，使用如表4所示的组合突变引物，进行多位点组合突变。
表4组合突变引物(N为A、G、C或T；D为A或G)
水解有机磷化合物活性提高的组合突变体的筛选、制备和纯化同实施例2。以比活力为考量指标，对获得的组合突变体进行水解对氧磷和甲基对硫磷活性评价。在此基础上分别获得水解两类有机磷化合物底物的最优突变体。水解对氧磷改良的组合突变体催化动力学参数列如表5。催化动力学参数测定反应体系包括不同终浓度的对氧磷或甲基对硫磷(0.5-3mM),0.4μM纯化酶蛋白，200μM氯化锰，50mM甘氨酸-氢氧化钠(pH8.5)，于55℃反应30min，95℃加热5min终止反应，酶标仪测定405nm处吸光值，以获得不同底物浓度下的反应速率。双倒数线计算酶反应米氏常数(Km)和最大反应速率vmax，根据vmax和酶浓度计算催化常数(kcat)，最终获得反应速率常数(kcat/Km)。最优情况是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第45位天冬氨酸和第226位组氨酸同时分别替换为色氨酸和甘氨酸(D45W/H226G)；水解甲基对硫磷改良的组合突变体催化动力学参数列如表6，最优情况是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第225位亮氨酸、第226位组氨酸和第343为组氨酸同时分别替换为酪氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(L225Y/H226L/H343I)(图1)。
表5水解对氧磷活性提高的组合突变体催化动力学参数
表6水解甲基对硫磷活性提高的组合突变体催化动力学参数
表5和表6中的WT是野生型二肽酶OPAA4301，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；D45W的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第45位天冬氨酸替换为色氨酸；H226G的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第226位组氨酸替换为甘氨酸；Y292F/L366F的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第292位酪氨酸替换为苯丙氨酸，同时第366位亮氨酸替换为苯丙氨酸；D45W/H226G的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第226位组氨酸替换为甘氨酸；D45W/Y292F/L366F的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第292位酪氨酸替换为苯丙氨酸，同时第366位亮氨酸替换为苯丙氨酸；D45W/H226G/Y292F/L366F的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第45位天冬氨酸替换为色氨酸，同时第226位组氨酸替换为甘氨酸，同时第292位酪氨酸替换为苯丙氨酸，同时第366位亮氨酸替换为苯丙氨酸；H343I的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第343位组氨酸替换为异亮氨酸；L225Y/H226L的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第225位亮氨酸替换为酪氨酸，同时第226位组氨酸替换为亮氨酸；L225Y/H226L/H343I的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，只是第225位亮氨酸替换为酪氨酸，同时第226位组氨酸替换为亮氨酸，同时第343为组氨酸替换为异亮氨酸。
从表5、表6和图1中可知，水解对氧磷最优的二肽酶突变体D45W/H226G催化速率常数kcat/Km为(2.96±0.05)×104M-1s-1，相较于野生型二肽酶OPAA4301提高了30.68倍；水解甲基对硫磷最优二肽酶突变体L225Y/H226L/H343I的催化速率常数kcat/Km为(1.10±0.02)×104M-1s-1，相较于野生型二肽酶OPAA4301提高了8837.71倍。
经改良后的二肽酶突变体水解有机磷类化合物的活力大幅提高，可有望应用于饲料添加剂、日化成分、环境治理试剂等方面。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可容易地对某些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的掲示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。