猪ApoE基因敲除打靶载体及其构建方法和应用与流程

文档序号:11126097阅读:来源:国知局

技术特征:

1.猪ApoE基因敲除打靶载体,其特征在于,所述打靶载体是以载体pLoxPneo作为骨架载体,所述打靶载体上包括正筛选元件、负筛选标记基因以及猪ApoE基因的5’同源臂和3’同源臂;

其中,所述正筛选元件包括顺次连接的重组酶识别序列-正筛选标记基因-重组酶基因-重组酶识别序列;

所述正筛选元件的一端与所述猪ApoE基因的3’同源臂连接,另一端与所述猪ApoE基因的5’同源臂连接;在所述猪ApoE基因的3’同源臂的外侧连接有负筛选标记基因。

2.根据权利要求1所述的打靶载体,其特征在于,所述正筛选标记基因包括编码新霉素磷酸转移酶、潮霉素B磷酸转移酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶或嘌呤霉素乙酰转移酶的基因;所述负筛选标记基因包括编码白喉毒素或胸腺去氧核苷的基因。

3.根据权利要求1或2所述的打靶载体,其特征在于,所述重组酶基因包括编码Cre酶或Flp酶的基因。

4.根据权利要求1-3任一项所述的打靶载体,其特征在于,所述正筛选元件为loxP-Neo-Cre-loxP。

5.根据权利要求1-4任一项所述的打靶载体,其特征在于,所述猪ApoE基因的5’同源臂和3’同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。

6.根据权利要求1-5任一项所述的打靶载体,其特征在于,所述打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

7.权利要求1-6任一项所述打靶载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:

S1、通过酶切连接的方法,在载体pLoxPneo中引入负筛选标记基因,得到载体ploxp-1;

S2、以猪基因组DNA为模板,设计PCR引物,分别扩增得到猪ApoE基因的5’同源臂和3’同源臂;将PCR扩增产物分别连接至pEASY-T载体中,然后进行测序;

S3、将测序正确的5’同源臂和3’同源臂,采用酶切连接的方法依次连接至载体ploxp-1上,得到载体ploxp-2;

S4、将正筛选元件引入载体ploxp-2中,即构建得到猪ApoE基因敲除打靶载体。

8.权利要求1-6任一项所述打靶载体在制备猪ApoE基因敲除动物模型中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,将所述打靶载体转染猪胎儿成纤维细胞,通过正负筛选获得中靶的阳性克隆细胞系,以所述阳性克隆细胞系为核移植供体细胞,成熟的猪卵母细胞为核移植受体细胞,通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎;将克隆胚胎移入发情期的受体母猪子宫内妊娠,获得ApoE基因敲除F0代猪,将所得F0代猪进行杂交繁育,获得的纯合子作为猪ApoE基因敲除动物模型。

10.猪ApoE基因敲除前体细胞系,其特征在于,用权利要求1-6任一项所述打靶载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得的中靶阳性细胞克隆,即为猪ApoE基因敲除前体细胞系;

其中,用于鉴定中靶阳性细胞克隆的特异性PCR引物包括:

SARM-S-F:5’-GGCTTTGGTTCCAGAGTTCACAGTC-3’

CRE-NHE1-R:

5’-TTCGAGAACTGCTAGCGGATCTCGGGGCAAGACAAATGTC-3’。

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