EGFR基因突变检测引物探针及其试剂盒的制作方法

文档序号:12097842阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种EGFR基因突变检测引物探针,其特征在于:包括用于检测19外显子E19-Dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a,用于检测20外显子T790M位点的突变上游引物b、突变探针b、野生上游引物b、野生探针b、通用下游引物b,以及用于检测21外显子L858R位点的突变上游引物c、突变探针c、野生上游引物c、野生探针c、通用下游引物c;

所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述下游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述缺失探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述检测探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;

所述突变上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,所述突变探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示,所述野生上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,所述野生探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示,所述通用下游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示;

所述突变上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示,所述突变探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示,所述野生上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示,所述野生探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示,所述通用下游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示;

所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端设有一种报告荧光基团,所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端设有另一种报告荧光基团,所述缺失探针a、检测探针a、突变探针b、野生探针b、突变探针c和野生探针c的3’端设有淬灭荧光基团;

所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.1μM/L~1.5μM/L,所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为1μM/L~3μM/L;

所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c在反应体系中的终浓度为0.1μM/L~0.19μM/L,所述检测探针a、野生探针b和野生探针c在反应体系中的终浓度为0.2μM/L~0.5μM/L。

2.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测引物探针,其特征在于:所述缺失探针a在反应体系中的终浓度为0.14μM/L,所述突变探针b在反应体系中的终浓度为0.16μM/L,所述突变探针c在反应体系中的终浓度为0.19μM/L;所述检测探针a在反应体系中的终浓度为0.2μM/L,所述野生探针b在反应体系中的终浓度为0.2μM/L,所述野生探针c在反应体系中的终浓度为0.22μM/L。

3.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测引物探针,其特征在于:所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.9μM/L~1.5μM/L,所述下游引物a在反应体系中的终浓度为0.9μM/L~1μM/L,所述通用下游引物b和通用下游引物c在反应体系中的终浓度为1.9μM/L~2μM/L。

4.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测引物探针,其特征在于:所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端的报告荧光基团是FAM,所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端的报告荧光基团是HEX 、VIC、TET或Cy3,所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。

5.一种采用如权利要求1所述的引物探针的EGFR基因突变检测产品。

6.一种EGFR基因突变检测试剂盒,其特征在于:包括用于配制数字PCR反应液的数字PCR预混液、液滴稳定剂和引物探针混合液;

所述引物探针混合液中包括用于检测19外显子E19-Dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a,用于检测20外显子T790M位点的突变上游引物b、突变探针b、野生上游引物b、野生探针b、通用下游引物b,以及用于检测21外显子L858R位点的突变上游引物c、突变探针c、野生上游引物c、野生探针c、通用下游引物c;

所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述下游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述缺失探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述检测探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;

所述突变上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,所述突变探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示,所述野生上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,所述野生探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示,所述通用下游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示;

所述突变上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示,所述突变探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示,所述野生上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示,所述野生探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示,所述通用下游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示;

所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端设有一种报告荧光基团,所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端设有另一种报告荧光基团,所述缺失探针a、检测探针a、突变探针b、野生探针b、突变探针c和野生探针c的3’端设有淬灭荧光基团;

所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.1μM/L~1.5μM/L,所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为1μM/L~3μM/L;

所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c在反应体系中的终浓度为0.1μM/L~0.19μM/L,所述检测探针a、野生探针b和野生探针c在反应体系中的终浓度为0.2μM/L~0.5μM/L。

7.根据权利要求6所述的EGFR基因突变检测试剂盒,其特征在于:所述缺失探针a在反应体系中的终浓度为0.14μM/L,所述突变探针b在反应体系中的终浓度为0.16μM/L,所述突变探针c在反应体系中的终浓度为0.19μM/L;所述检测探针a在反应体系中的终浓度为0.2μM/L,所述野生探针b在反应体系中的终浓度为0.2μM/L,所述野生探针c在反应体系中的终浓度为0.22μM/L;所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.9μM/L~1.5μM/L,所述下游引物a在反应体系中的终浓度为0.9μM/L~1μM/L,所述通用下游引物b和通用下游引物c在反应体系中的终浓度为1.9μM/L~2μM/L。

8.根据权利要求6所述的EGFR基因突变检测试剂盒,其特征在于:所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端的报告荧光基团是FAM,所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端的报告荧光基团是HEX 、VIC、TET或Cy3,所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。

9.根据权利要求6所述的EGFR基因突变检测试剂盒,其特征在于:所述数字PCR预混液中包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、参比荧光ROX和缓冲液;所述液滴稳定剂中包括矿物油。

10.根据权利要求6所述的EGFR基因突变检测试剂盒,其特征在于:反应时,反应体系中包括数字PCR预混液10体积,引物探针混合液2体积,液滴稳定剂2体积,模板1体积,灭菌超纯水5体积,所述模板的使用浓度为0.1ng/ul~1ng/ul。

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