用于检测HLA‑B27基因的检测试剂盒和方法与流程

文档序号:12098007阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于检测HLA-B27基因的检测试剂盒,其特征在于,该检测试剂盒包括用于HLA-B*27:04基因检测的引物对1及检测探针1,和用于HLA-B*27:05基因检测的引物对2及检测探针2;其中,所述引物对1的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示,所述检测探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述引物对2的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示,所述检测探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述引物和探针检测试剂盒还包括内部质控,其包括质控引物对和质控探针,所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示,所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒还包括HLA-B*27:04阳性对照物、HLA-B*27:05阳性对照物,其中,所述HLA-B*27:04阳性对照物含有如SEQ ID No.10和SEQ ID No.12所示的核苷酸序列,所述HLA-B*27:05阳性对照物含有如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1-3中任一所述的检测试剂盒,其特征在于,所述检测探针1和所述检测探针2的5'端连接荧光基团,3'端连接淬灭基团。

5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,该试剂盒还包括10×PCR缓冲液、热启动DNA聚合酶、dNTPs、矿物油、阴性对照物:ddH2O;所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一种,所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

6.一种快速检测HLA-B27基因的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:

(1)从样品中提取DNA;

(2)对提取的所述DNA,同时进行HLA-B*27:04基因检测的反应体系1和HLA-B*27:05基因检测的反应体系2的实时荧光PCR扩增;其中,在所述反应体系1中检测引物对1的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示,检测探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;在所述反应体系2中检测引物对2的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示,检测探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示,所述检测探针1和所述检测探针2的5'端连接荧光基团,3'端连接淬灭基团;

(3)收集荧光信号,选择对应荧光基团的荧光检测模式,基线调整取3~15个循环的荧光信号,以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线;

(4)结果判定:待测样品的所述HLA-B*27:04基因检测的反应体系1或所述HLA-B*27:05基因检测的反应体系2任一体系的荧光扩增曲线呈现典型的“S”型曲线,且Ct值≤26,则该待检样本基因型为HLA-B27阳性,否则为HLA-B27阴性。

7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中,所述反应体系1和所述反应体系2中还包括有作为内部质控的质控引物对和质控探针,所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示,所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示,该质控探针的5'端连接有不同于所述检测探针1和检测探针2的荧光基团,3'端连接有不同于所述检测探针1和检测探针2的淬灭基团。

8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中,在所述反应体系1和所述反应体系2中,各自的检测引物和检测探针的终浓度均为300nmol/L,所述质控引物对和所述质控探针的终浓度均为200nmol/L;所述检测探针1和2的5'端连接FAM,3'端连接MGB,所述质控探针的5'端连接JOE,3'端连接TAMRA。

9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述实时荧光PCR扩增的反应程序为:

第一阶段:95℃变性10min;

第二阶段:94℃30s,58℃30s,10个循环;

第三阶段:94℃30s,60℃30s,30个循环;

信号收集:第三阶段收集荧光信号;

在所述步骤(4)中,检测样本的所述内部质控的JOE信号应有典型的“S”型扩增曲线,且其Ct值<25,再确定所述样本DNA的阴阳性;否则应重新进行检测。

10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中,还设有阳性对照和阴性对照,所述阳性对照为以含有如SEQ ID No.10和SEQ ID No.12核苷酸序列所示的HLA-B*27:04阳性对照物、含SEQ ID No.11和SEQ ID No.12核苷酸序列所示的HLA-B*27:05阳性对照物为模板,进行所述反应体系1和反应体系2的实时荧光PCR扩增;

所述阴性对照为以ddH2O为模板,进行所述反应体系1和反应体系2的实时荧光PCR扩增;

在步骤(4)中,所述阳性对照的反应体系1和反应体系2的FAM均有典型的“S”型扩增曲线,FAM信号的Ct值≤26,且JOE有典型的“S”型扩增曲线且JOE信号的Ct值<25,符合要求;

所述阴性对照的反应体系1和反应体系2的FAM、JOE均没有扩增曲线或Ct值,符合要求;否则,应重新进行体系配置,重新检测。

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