一种土霉素降解菌株的筛选方法与流程

文档序号:11144875阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种土霉素降解菌株的筛选方法,特征在于,包括以下过程:

1)土霉素降解菌株的分离

采集菌肥,将菌肥加入到蒸馏水中,混合,提取菌肥浸出液;

吸取菌肥浸出液,涂布于土霉素含量不同的无机盐固体培养基平板上,置于30℃条件下遮光培养2天,得到菌落;

2)菌株纯化

将步骤1)分离得到的菌落,在含有土霉素的无机盐固体培养基平板上划线,进一步分离和纯化;此步骤重复2-3次,直至得到单一菌落;然后将单菌落接入含有土霉素的无机盐液体培养基中,置于30℃,150r/min震荡条件下,遮光培养2天,得到单一菌落培养液;

3)菌株降解功能验证

将步骤2)得到的培养液,在土霉素为唯一碳源且土霉素浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线,在30℃避光培养2天;能够生长的菌株即为能够以土霉素为唯一碳源的降解菌株;

4)菌株降解活性测定

将步骤3)得到的能在土霉素为唯一碳源生长的菌株,转接到细菌活化培养基上进行活化;然后将活化的菌液按1%的接种量。转接到以土霉素为唯一碳源且浓度适宜的无机盐液体培养基中,30℃,150r/min震荡培养7天,最后用高效液相色谱法测定菌株对土霉素的降解率;试管斜面保存不同浓度降解率高的菌株,4℃储存。

2.根据权利要求1所述的一种土霉素降解菌株的筛选方法,其特征在于:步骤1)中菌肥和蒸馏水的添加比例为1g:10ml,吸取菌肥浸出液的体积为100ul。

3.根据权利要求1所述的一种土霉素降解菌株的筛选方法,其特征在于:步骤1)中中所述的无机盐固体培养基中土霉素含量为25mg/l-100mg/l。

4.根据权利要求1所述的一种土霉素降解菌株的筛选方法,其特征在于:步骤1)中无机盐固体培养基的组成为:氯化铵1g,磷酸二氢钾0.5g,磷酸氢二钾1.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠1g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,调节pH至7.0,高压灭菌;在倒平板前,在培养基中添加土霉素,添加浓度依次为25、50、100mg/l,摇匀。

5.根据权利要求1所述的一种土霉素降解菌株的筛选方法,其特征在于:步骤2)中无机盐固体培养基的组成为:氯化铵1g,磷酸二氢钾0.5g,磷酸氢二钾1.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠1g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,调节pH至7.0,高压灭菌;在倒平板前,在培养基中添加土霉素,添加浓度依次为25mg/l,摇匀。

6.根据权利要求1所述的一种土霉素降解菌株的筛选方法,其特征在于:步骤2)中无机盐液体培养基的组成为:氯化铵1g,磷酸二氢钾0.5g,磷酸氢二钾1.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠1g,蒸馏水1000ml,调节pH至7.0,高压灭菌;在冷却到室温后,在培养基中添加土霉素,添加浓度为25mg/l,摇匀。

7.根据权利要求1所述的一种土霉素降解菌株的筛选方法,其特征在于:步骤3)中无机盐固体培养基的组成为:氯化铵1g,磷酸二氢钾0.5g,磷酸氢二钾1.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠1g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,调节pH至7.0,高压灭菌;在倒平板前,在培养基中添加土霉素,添加浓度依次为50mg/l、100mg/l,摇匀。

8.据权利要求1所述的一种土霉素降解菌株的筛选方法,其特征在于:步骤4)中细菌活化培养基为牛肉膏蛋白胨培养基,其配方为:牛肉膏3g,蛋白胨5g。氯化钠5g,琼脂18g,蒸馏水定容至1000ml,用1mol/l氢氧化钠调节pH至7.0-7.2后灭菌。

9.据权利要求所述的一种土霉素降解菌株的筛选方法,其特征在于;所述的步骤1)和步骤2)包括以下过程:

a)菌种富集

采集菌肥,称取菌肥10g,加至装有100ml灭菌蒸馏水的三角瓶中,三角瓶中含玻璃珠,在恒温摇床上以30℃,200r/min震荡30min,取出后静置;吸取1ml菌肥浸出液装入100ml富集培养基的500ml的三角瓶中,30℃,150r/min震荡条件下,暗培养2天;然后取10ml培养液转入新的相同的培养基中,在相同的条件下继续富集培养一次;

无机盐液体富集培养基组成为:氯化铵1g,磷酸二氢钾0.5g,磷酸氢二钾1.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠1g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,调节pH至7.0,分装到250ml三角瓶中,高压灭菌,在超净工作台中添加土霉素,添加浓度依次为25、50、100mg/l,摇匀;

b)菌株分离

吸取100ul上述富集培养液,分别一一对应涂布于上面所述3种不同土霉素浓度的无机盐固体培养基平板上,置于30℃条件下遮光培养2天;

无机盐固体培养基的组成为:氯化铵1g,磷酸二氢钾0.5g,磷酸氢二钾1.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠1g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,调节pH至7.0,高压灭菌;在倒平板前,在培养基中添加土霉素,添加浓度与无机盐液体富集培养基相同。

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