单链LIGHT受体激动剂蛋白的制作方法

本发明提供了包括三个可溶性LIGHT结构域和Fc片段的特异性LIGHT受体激动剂蛋白，编码LIGHT受体激动剂蛋白的核酸分子及其用途。LIGHT受体激动剂蛋白基本上是非聚集的并且适用于治疗、诊断和/或研究应用。
背景技术：
：已知TNF超家族(TNFSF)细胞因子的三聚化对于有效的受体结合和活化是必需的。然而，TNF超家族细胞因子的三聚体复合物难以从重组单体单元制备。WO01/49866和WO02/09055公开了包括TNF细胞因子和多聚化组分的重组融合蛋白，特别是来自C1q蛋白家族的蛋白质或胶原凝集素。然而，这些融合蛋白的缺点是三聚化结构域通常具有较大的分子量和/或三聚化效率相当低。Schneider等人(JExpMed187(1989),1205-1213)描述了TNF细胞因子的三聚体通过N末端定位的稳定基序来稳定。在CD95L中，受体结合结构域三聚体的稳定化可能是由位于细胞质膜附近的N末端氨基酸结构域引起的。Shiraishi等人(BiochemBiophysResCommun322(2004),197-202)描述了CD95L的受体结合结构域可以通过N-末端定位的人工α螺旋卷曲螺旋(亮氨酸拉链)基序稳定。然而，发现多肽链彼此的取向，例如平行或反平行取向，很难预测的。此外，卷曲螺旋拉链基序中七价重复序列的最佳数目很难确定。另外，卷曲螺旋结构具有在改变pH和/或离子强度后形成大分子聚集体的倾向。WO01/25277涉及结合细胞受体的细胞外配体结合结构域的单链寡聚多肽，其中所述多肽包括至少三个受体结合位点，其中至少一个受体结合位点能够结合到细胞受体的配体结合结构域，并且至少一个受体结合位点不能有效结合到细胞受体的配体结合结构域，由此单链寡聚多肽能够结合到受体，但不能激活受体。例如，单体来源于TNF家族的细胞因子配体，特别是来自TNF-α。WO2005/103077公开了单链融合多肽，其包括TNF家族配体成员中的至少三个单体和将TNF配体家族成员的单体彼此连接的至少两个肽接头。然而，最近的实验已经表明，这些单链融合多肽表现出不想要的聚集。WO2010/010051公开了包括三个可溶性TNF家族细胞因子结构域和至少两个肽接头的单链融合多肽。所描述的融合多肽基本上是非聚集的。该领域需要展现出独立于基于Fc-γc-的体内交联的高生物学活性、高稳定性和允许有效重组制备的新型的LIGHT受体激动剂。此外，因为人LIGHT在体内具有至少三种相互作用配偶体：LT-β-R、DcR3和HVEM，所以在该领域需要能够产生人LIGHT受体选择性生物制剂的技术。技术实现要素：本发明提供了模拟体内一种或多种LIGHT受体：LIGHT相互作用的特异性LIGHT受体激动剂蛋白，与激动性单克隆抗体相比，其展现了低的蛋白水解降解和更短的体内半衰期。本发明的LIGHT受体激动剂蛋白通常包括：(i)第一可溶性LIGHT细胞因子结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性LIGHT结构域；(iv)第二肽接头；(v)第三可溶性LIGHT结构域；(vi)第三肽接头(例如，铰链接头)和(vii)抗体Fc片段。在一种实施方式中，抗体Fc片段(vii)位于第一LIGHT结构域(i)的N末端和/或第三LIGHT结构域(v)的C末端。在另一种实施方式中，抗体Fc片段在C末端上位于第三LIGHT结构域(v)。在一种实施方式中，该多肽基本上是非聚集的。在另一种实施方式中，第二和/或第三可溶性LIGHT结构域是任选地包括氨基酸序列突变的N末端缩短结构域。在一种实施方式中，该可溶性LIGHT结构域中的至少一个，特别是可溶性LIGHT结构域(iii)和(v)中的至少一个，是具有开始于人LIGHT的氨基酸Glu91或Asn93或Pro94的N末端序列的可溶性LIGHT结构域，其中Glu91或Asn93或Pro94可以被中性氨基酸，例如Ser或Gly替换。在另一种实施方式中，该可溶性LIGHT结构域中的至少一个，特别是可溶性LIGHT结构域(iii)和(v)中的至少一个是具有选自以下的N末端序列的可溶性LIGHT结构域：(a)Asn93-Ala95和(b)(Gly/Ser)93-Ala95。在一种实施方式中，可溶性LIGHT结构域以人LIGHT的氨基酸Val240结束和/或任选地包括在位置N93、N102、E115、T116、Q117、L118、G119、L120、C154、R172、Y173、E175、E176、E178、C187、R228、D229处的一种或多种突变。在一种实施方式中，可溶性LIGHT结构域(i)、(iii)和(v)包括根据SEQIDNO：01的人LIGHT的氨基酸Glu91–Val240。在一种实施方式中，该可溶性LIGHT结构域中的至少一个，特别是至少可溶性LIGHT结构域(i)是具有N末端序列的可溶性LIGHT结构域，其起始于氨基酸Glu91并且其中Glu91可以被Gln替换。在一种实施方式中，第一和第二肽接头(ii)和(iv)独立地具有3-8个氨基酸的长度，特别是3、4、5、6、7或8个氨基酸的长度，并且优选为甘氨酸/丝氨酸接头，任选地包括可被糖基化的天冬酰胺残基。在一种实施方式中，第一和第二肽接头(ii)和(iv)由根据SEQIDNO：2的氨基酸序列组成。在另一种实施方式中，该多肽另外包括例如SEQIDNO：17的N末端信号肽结构域，其可以包括蛋白酶切割位点，和/或N该端信号肽结构域包括C末端元件，该C末端元件可以包括和/或连接至识别/纯化结构域，例如连接至根据SEQIDNO：18的丝氨酸接头的Strep标签。在一种实施方式中，抗体Fc片段(vii)通过铰链接头，优选地通过SEQIDNO：16的铰链接头，融合至可溶性LIGHT结构域(i)和/或(v)。在另一实施方式中，抗体Fc片段(vii)由如SEQIDNO：13或14中所示的氨基酸序列组成。在一种实施方式中，本发明的单链融合多肽包括选自SEQIDNO：15和25-32组成的组的氨基酸序列。在一种实施方式中，本发明提供了包括两种单链融合多肽的二聚体的LIGHT受体激动剂蛋白，每种融合多肽具有SEQIDNO：27中所示的氨基酸序列。在一种实施方式中，两种多肽通过在每种多肽的半胱氨酸残基468、474和477之间形成的三个链间二硫键来共价连接。在一种实施方式中，一种或多种成熟多肽SEQIDNO:27、28、29、30和32的位置156处的天冬酰胺残基是N糖基化的。在另一种实施方式中，该多肽SEQIDNO:31的位置156和312处的天冬酰胺残基都是N-糖基化的。在另一种实施方式中，该一种或多种多肽进一步经翻译后修饰。在另一种实施方式中，翻译后修饰包括将E91Q突变蛋白的N末端谷氨酰胺修饰为焦谷氨酸。附图说明图1包括三个LIGHT结构域的单链融合多肽的结构域结构。I.、II.、III.可溶性LIGHT结构域。图2表示LIGHT一般结构的示意图。■■■细胞膜，位于细胞内的N末端，1.受体结合结构域(RBD)的反平行β折叠，2.RBD与细胞膜的界面，3.蛋白酶切割位点。图3包括另外的Fab抗体片段的单链融合多肽。图4通过三个二硫桥将两个C末端融合的scFc融合多肽二聚化。图5表示本发明的六价单链LIGHT受体激动剂融合蛋白的示意图。存在于内表面区域上的CH2碳水化合物(5)通常在“开放的Fc构象转变”期间通常在空间位阻上保护CH2亚结构域(2)免受蛋白酶影响，其中铰链-链间二硫键(4)被还原并且共价的链间连接被破坏。这使得CH2解离并使内表面区域和上铰链赖氨酸K223(6)暴露于蛋白酶。由于CH3结构域(3)彼此之间的高的亲和力，因此“开放阶段”中的二聚体缔合(association)仍然完整。(1)scLIGHT-RBD；(2)CH2结构域；(3)CH3结构域；(4)铰链半胱氨酸(左侧：氧化成二硫桥；具有游离巯基的右侧还原阶段)；(5)连接至位置N297(EU编号)的CH2碳水化合物；(6)上铰链赖氨酸(K223)。图6使用TosohTSK凝胶G3000SWxl柱在1260无限HPLC系统上对蛋白A(A)和蛋白B(B)进行分析性尺寸排除层析。该柱中载有浓度为0.94mg/ml(A)或0.77mg/ml(B)总体积为20μl的蛋白质。流速设定为0.5ml/min。人们在16.239(A)和15.842min(B)观察到单个主峰。具体实施方式本发明提供了包括由两个肽接头连接的至少三个可溶性LIGHT结构域和在N末端和/或C末端上的抗体来源的二聚化结构域的单链融合多肽。本发明人已经发现通过二聚化结构域的两个单链融合多肽的二聚化产生了六价LIGHT受体激动剂，其提供了高生物学活性和良好的稳定性。优选地，单链融合多肽是非聚集的。术语“非聚集的”是指制剂中单体含量≥50％，优选≥70％，更优选≥90％。单体含量与聚集体含量的比率可以通过使用尺寸排阻层析法(SEC)检查聚集体形成的量来确定。关于聚集的稳定性可以通过SEC在不同的储存条件下(例如4℃或25℃)限定的时间段(例如从数天到若干天，直至数周和数月)之后确定。对于融合蛋白，为了分类为基本上的非聚集的，优选的是，在4℃或25℃储存若干天(例如10天)的时间段之后，更优选若干周(例如2、3或4周)的时间段之后，并且最优选在若干月(例如2或3个月)的时间段之后，“单体”含量如上文所限定。关于在FC融合蛋白的情况下“单体”的限定，两条多肽链的组装由FC部分驱动，并且所得组装蛋白的功能单元由两条链组成。该单元在Fc融合蛋白的情况下被限定为“单体”，这与二聚化单链融合多肽无关。单链融合多肽可以包括可以位于其N末端和/或C末端的另外的结构域。另外的融合结构域的实例是，例如可以包括蛋白酶切割位点的N末端信号肽结构域，或可以包含和/或连接识别/纯化结构域的C末端元件。根据优选的实施方式，融合多肽在其C末端包括经由接头融合的Strep标签。包括短的丝氨酸接头的示例性Strep标签在SEQIDNO:18中示出。本发明的LIGHT受体激动剂蛋白包含来源于LIGHT的三个可溶性结构域。优选地，这些可溶性结构域来源于哺乳动物，特别是来源于包括等位基因变体的人LIGHT和/或其衍生物。可溶性结构域包含包括受体结合结构域而无膜定位结构域的LIGHT的细胞外部分。像TNF超家族的其他蛋白质一样，LIGHT经由15-30个氨基酸的N末端部分(即所谓的茎区)锚定到膜。茎区有助于三聚化，并提供了到细胞膜一定的距离。然而，茎区不是受体结合结构域(RBD)的一部分。重要的是，RBD的特征在于其N末端氨基酸和C末端氨基酸的特定位置。所述氨基酸是紧邻的，并且位于三聚体的轴的中心。RBD的第一N末端氨基酸形成具有RBD的C末端氨基酸的反平行β链(图2)。因此，RBD的反平行β链与细胞膜形成界面，其经由茎区的氨基酸连接并锚定在细胞膜内。特别优选的是，LIGHT受体激动剂蛋白的可溶性LIGHT结构域包括缺少来自茎区域的任何氨基酸的LIGHT的受体结合结构域。否则，需要将可溶性结构域中的一个的C末端与下一个可溶性结构域的N末端连接的长接头来补偿该下一个可溶性结构域的N末端茎区，这可能导致不稳定性和/或聚集体的形成。这种可溶性结构域的另一个优点是RBD的N-端氨基酸不可用于任何抗药物抗体。优选地，该单链融合多肽由以下组成：(i)第一可溶性LIGHT细胞因子结构域；(ii)第一肽接头：(iii)第二可溶性LIGHT结构域；(iv)第二肽接头；(v)第三可溶性LIGHT结构域，该单链融合多肽能够形成模拟其天然配对物(counterpart)的三聚体组织的有序结构，从而包括至少一个用于相对LIGHT受体的功能结合位点。因此，包括组分(i)-(v)的单链融合多肽也称为单链LIGHT受体结合域(scLIGHT-RBD)。LIGHT受体激动剂蛋白包括三个功能性LIGHT受体结合位点，即能够与LIGHT受体形成复合物的氨基酸序列。因此，可溶性结构域能够结合到相应的LIGHT受体。在一种实施方式中，可溶性结构域中的至少一个能够受体激活，由此可能影响凋亡和/或增殖活性。在另一种实施方式中，可溶性结构域中的一个或多个被选作为不能受体激活。可溶性LIGHT结构域可以源自人LIGHT，如SEQIDNO：1中所示的。优选地，可溶性LIGHT结构域来源于人LIGHT，特别是从氨基酸91或94开始，特别包括SEQIDNO：1的氨基酸91-240或94-240。任选地，SEQIDNO:1的氨基酸Glu91可以被不带电荷的氨基酸例如Ser或Gl替置换，或者被谷氨酰胺替换。表1：野生型人LIGHT蛋白的序列如上所示，可溶性LIGHT结构域可以包括如SEQIDNO：1中所示的野生型序列。然而，应该注意的是，可能这些可溶性结构域中的在一个或多个中引入突变，例如改变(例如增加或减少)可溶性结构域的结合性质的突变。在一种实施方式中，可以选择不能与相应的细胞因子受体结合的可溶性结构域。在本发明的另一种实施方式中，可溶性LIGHT结构域(i)包括导致LIGHT受体亲和力降低和/或LIGHT受体活化降低的LIGHT的突变体或其受体结合结构域。影响受体结合和/或活性的LIGHT突变蛋白该突变体可以通过技术人员已知的任何技术生成。取代可影响LIGHT的至少一个氨基酸，例如如本文所述的人LIGHT(例如，SEQIDNO：1)或其受体结合结构域。在这方面优选的取代影响SEQIDNO:1的人LIGHT的以下氨基酸中的至少一种：E115、T116、Q117、L118、G119、L120、R172、Y173、E175、E176、E178、R228、D229。在优选的实施方式中，Y173突变为S、T、D、E、R或F。人LIGHT在体内具有至少三种不同的受体/相互作用配偶体，即LT-T-R、DcR3和HVEM。一种或多种氨基酸取代可对于或在一种或多种LIGHT受体结合或一种或多种LIGHT受体诱导的信号转导方面影响LIGHT(例如，人LIGHT)的结合和/或活性。LIGHT受体的结合和/或活性可以被积极地影响，即更强、更具选择性或更特异性的受体结合和/或更多的受体活化。可替换地，LIGHT受体的结合和/或活性可以被消极地影响，即较弱、较少选择性或较少特异性的一种受体或多种受体的结合和/或一种受体或多种受体较少或没有活化。因此，一种实施方式是如本文所述的LIGHT受体激动剂蛋白，其中该可溶性结构域中的至少一个包括LIGHT的突变体或其受体结合结构域，其与野生型LIGHT相比更小程度的结合和/或激活一种或多种LIGHT受体。本发明的单链融合分子包括三个可溶性LIGHT结构域，即组分(i)、(iii)和(v)。如果第二和/或第三可溶性LIGHT结构域是任选地包括氨基酸序列突变的N末端缩短的结构域，则单链LIGHT融合多肽针对聚集的稳定性得到增强。因此，优选地，第二和第三可溶性LIGHT结构域都是N末端缩短的结构域，其任选地包括N末端区域中优选地在可溶性LIGHT结构域的N末端的前五个氨基酸内的氨基酸序列突变。这些突变可以包括用中性氨基酸，特别是丝氨酸或甘氨酸替换碱性氨基酸。与此相反，第一可溶性LIGHT结构域的选择并不重要。在此，可以使用具有全长N末端序列的可溶性结构域。然而，应该注意的是，第一可溶性LIGHT结构域也可以具有N末端缩短的且任选突变的序列。在本发明另一优选的实施方式中，可溶性LIGHT结构域(i)、(iii)和(v)是可溶性人LIGHT结构域。第一可溶性LIGHT结构域(i)可以选自天然的、缩短的和/或突变的序列。因此，第一可溶性LIGHT域(i)具有N末端序列，其可起始于人LIGHT的氨基酸Glu91或Ala95，并且其中Glu91可以由中性氨基酸替换，例如由Ser或Gly或由Gln替换，以在表达期间能够形成焦谷氨酸。第二和第三可溶性LIGHT结构域(iii)和(v)具有缩短的N末端序列，其优选起始于人LIGHT(SEQIDNO：1)的氨基酸Asn93或Pro94，并且其中Asn93可以被另一个氨基酸，例如Ser或Gly替换。优选地，可溶性LIGHT结构域(iii)和(v)的N末端序列选自：(a)Asn93或Pro94(b)(Gly/Ser)93。可溶性LIGHT结构域优选以人LIGHT的氨基酸V240结束。在某些实施方式中，LIGHT结构域可以包括如上所述的内部突变。LIGHT受体激动剂蛋白的组分(ii)和(iv)是分别位于组分(i)和(iii)之间或(iii)和(v)之间的肽接头元件。柔性接头元件具有3-8个氨基酸的长度，特别是3、4、5、6、7或8个氨基酸的长度。接头元件优选为甘氨酸/丝氨酸接头，即基本上由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成的肽接头。在其中可溶性细胞因子结构域以S或G(N-末端)开始的情况下，接头在该S或G之前结束。应该注意的是，接头(ii)和接头(iv)不需要具有相同的长度。为了减少潜在的免疫原性，其可以优选使用较短的接头。另外，结果表明较短的接头导致单链分子具有降低形成聚集体的趋势。然而，比本文公开的接头长得多的接头可以表现出不利的聚集特性。如果需要，接头可包括可形成糖基化位点Asn-Xaa-Ser的天冬酰胺残基。在某些实施方式中，接头之一，例如接头(ii)或接头(iv)包括糖基化位点。在其他实施方式中，接头(iv)二者都包含糖基化位点。为了增加LIGHT激动剂蛋白的溶解度和/或为了降低潜在的免疫原性，优选接头(ii)或接头(iv)或两者都包括糖基化位点。表2中示出了优选的接头序列。优选的接头是GSGSGNGS(SEQIDNO：2)。其他优选的接头是GSGS(SEQIDNO：11)。表2：接头序列实例SEQIDNO序列2GSGSGNGS3GSGSGSGS4GGSGSGSG5GGSGSG6GGSG7GGSGNGSG8GGNGSGSG9GGNGSG10GSGSGS11GSGS12GSGLIGHT受体激动剂蛋白另外包括抗体Fc片段结构域，其可位于第一LIGHT结构域(i)的N末端和/或第三LIGHT结构域(v)的C末端。优选地，抗体Fc片段结构域包括降低的与Fc-γ-R受体体内相互作用的能力。优选地，抗体Fc片段结构域包括SEQIDNO：13或14中所示的氨基酸序列或由其组成(见表3)。与野生型人IGG1-Fc相比，序列IDNO:13具有N297S突变，并且不结合于Fc-γ-R受体。序列IDNO:14是具有降低的Fc-γ-R结合能力的糖基化的(N297野生型)人IGG1Fc突变蛋白。表3：Fc片段结构域的实例糖基化位点的数量和体内稳定性糖基化位点的总数和三维碳水化合物的单个位置影响LIGHT受体激动剂蛋白质的体内稳定性。此外，碳水化合物识别取决于末端糖的局部密度，碳水化合物树(tree)的分支，以及碳水化合物与其他物质彼此的相对位置。此外，部分降解的碳水化合物通过凝集素驱动机制降低LIGHT受体激动剂蛋白的体内半衰期。通过减少分子表面上糖基化位点的总数和/或它们的相对位置，所得到的化合物不易适于这些机制，从而增加半衰期。在优选的实施方式中，第一接头(ii)被糖基化而第二接头(iv)未被糖基化以避免在蛋白质可接近表面上的非常接近的碳水化合物模式。在优选实施方式中，具有(SEQIDNO:2)和(SEQIDNO:11)的接头在一个scLIGHT-RBD模块中组合。为了避免体内基于Fc受体的交联和可能的基于LIGHT受体超簇的毒性，减少抗体CH2结构域碳水化合物是必需的。另外，不需要的Fc驱动的机制如ADCC可能导致有毒事件。因此，在一种实施方式中，本发明的LIGHT受体激动剂蛋白上的糖基化位点的总数通过CH2糖基化位点，特别是N糖基化位点的减少而减少，导致包括产生无糖基CH2结构域的SEQIDNO:15(蛋白A)(根据EU编号系统)的N297S等效突变的LIGHT受体激动剂蛋白。在本发明的另一种实施方式中，可溶性LIGHT结构域(i)，(iii)和(v)中的一个或多个可以包括交换成天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸的N102，从而产生具有糖基化位点数量进一步减少的LIGHT受体激动性融合蛋白。在优选的实施方式中，N102[D，S，G]突变限于本发明的激动性LIGHT受体激动性融合蛋白的可溶性LIGHT结构域(iii)和(v)。CH2结构域去稳定化通过另外的铰链半胱氨酸来补偿存在于内表面区域上的CH2(重链恒定结构域2)糖基化通常在“开放的Fc构象转变”期间保护亚结构域免受蛋白酶影响，其中铰链-链间二硫键被还原并且共价的链间连接被破坏(图5)。这使得CH2解离并使内表面区域暴露于蛋白酶。包括具有SEQIDNO:15(蛋白A)(根据EU编号系统)的N297S等效突变的LIGHT受体激动剂蛋白产生无糖基化CH2，并且因此可能经受蛋白酶消化并且与具有野生型CH2糖基化的等效结构比更不稳定。在宿主细胞蛋白酶存在并且长期作用该结构的情况下，这会影响化合物在USP/DSP/存储期间的稳定性。因此，在某些实施方式中，LIGHT受体激动剂缺乏CH2糖基化位点，但在每条多肽链的接头序列(例如GSGSGNGS，SEQIDNO：2)中包括糖基化位点。根据本发明的优选实施方式，抗体Fc片段结构域经由铰链接头元件融合。铰链接头元件具有10-30个氨基酸的长度，特别是15-25个氨基酸的长度，例如22个氨基酸。术语“铰链接头”包括足够长以允许铰链接头元件连接的结构域获得生物学活性确认的任何接头。铰链接头元件优选包括免疫球蛋白的铰链区序列，在本文中指的是“Ig铰链区”。术语“Ig铰链区”是指包括与含有一个或多个半胱氨酸残基(例如两个半胱氨酸残基)的天然存在的Ig铰链区序列的一部分具有序列同一性或相似性氨基酸序列的任何多肽，在该Ig铰链区序列处二硫键连接免疫球蛋白的两个重链。铰链区的衍生物和类似物可通过突变获得。本文所指的衍生物或类似物是包括与野生型(或天然存在的蛋白质)的全长序列具有序列同一性或相似性的氨基酸序列的多肽，除了其具有可归因于删除，插入和/或取代的一个或多个氨基酸序列差异。单个LIGHT受体激动剂蛋白中具有开放Fc构象的分子的数目取决于存在于铰链区中的链间二硫键的数目。因此，在一种实施方式中，将第三个半胱氨酸(根据EU编号系统的C225)引入本发明的LIGHT受体激动剂蛋白的铰链区，以改善减少CH2糖基化位点的作用。在铰链区中将赖氨酸交换成甘氨酸导致蛋白水解稳定性的增强在一种实施方式中，本发明的LIGHT受体激动剂蛋白另外包括上铰链赖氨酸(根据EU编号系统的K223)至甘氨酸的突变，以降低在该位点的蛋白水解加工，从而增强该融合蛋白的整体稳定性。将上述第三半胱氨酸(根据EU编号系统的C225)的引入与上述在铰链区内的赖氨酸至甘氨酸突变(根据EU编号系统的K223G)组合导致本发明的整体稳定化的LIGHT受体激动剂蛋白质。包括上述半胱氨酸(C225)和赖氨酸至甘氨酸突变(K223G)的特别优选的铰链接头元件包括SEQIDNO：16中所示的氨基酸序列或由其组成(表4)。LIGHT受体激动剂蛋白可另外包括N末端信号肽结构域，其允许在合适的宿主细胞中进行处理，例如细胞外分泌。优选地，N末端信号肽结构域包括蛋白酶切割位点，例如信号肽酶切割位点，因此可以在表达后或表达期间被去除以获得成熟蛋白质。特别优选的N末端信号肽结构域包括如SEQIDNO:17中所示的氨基酸序列(表4)。此外，LIGHT受体激动剂蛋白可另外包括具有例如1-50个，优选10-30个氨基酸长度的C末端元件，其可包括或连接至识别/纯化结构域，例如FLAG结构域、Strep标签或Strep标签Il结构域和/或聚His结构域。根据优选的实施方式，融合多肽包括经由如SEQIDNO:18中所示的短的丝氨酸接头融合至C末端的Strep标签(表4)。优选的铰链接头元件(SEQIDNO:16、19-24)、优选的N-末端信号肽结构域(SEQIDNO:17)和丝氨酸接头strep标签(SEQIDNO:18)在表4中示出。表4：示例性结构域和接头SEQIDNO序列16GSSSSSSSSGSCDKTHTCPPC17METDTLLVFVLLVWVPAGNG18SSSSSSAWSHPQFEK19GSSSSSSSGSCDKTHTCPPC20GSSSSSSGSCDKTHTCPPC21GSSSSSGSCDKTHTCPPC22GSSSGSCDKTHTCPPC23GSSSGSCDKTHTCPPCGS24GSSSGSCDKTHTCPPCGSGS在本发明的一种实施方式中，融合多肽包括由两种不同肽接头元件融合的三个可溶性LIGHT结构域。第一接头元件(ii)由SEQIDNO:2组成。第二接头元件(iv)由SEQIDNO:11组成。第一可溶性LIGHT结构域(i)由根据SEQIDNO:1的人LIGHT的氨基酸91-240组成，可溶性LIGHT结构域(iii)和(v)由根据SEQIDNO:1的人LIGHT的氨基酸94-240组成。得到的scLIGHT-RBD序列模块在表5bSEQIDNO:36中示出。在本发明的另一种实施方式中，融合多肽包括由SEQIDNO:2的肽接头元件融合的三个可溶性LIGHT结构域。第一可溶性LIGHT结构域(i)由根据SEQIDNO:1的人LIGHT的氨基酸91-240组成，可溶性LIGHT结构域(iii)和(v)由根据SEQIDNO:1的人LIGHT的氨基酸93-240组成。得到的scLIGHT-RBD序列模块在表5bSEQIDNO:39中示出。在本发明的另一种实施方式中，融合多肽包括由SEQIDNO:2的肽接头元件融合的三个可溶性LIGHT结构域。第一可溶性LIGHT结构域(i)由根据SEQIDNO:1的人LIGHT的氨基酸91-240组成，可溶性LIGHT结构域(iii)和(v)由根据SEQIDNO:1的人LIGHT的氨基酸94-240组成。得到的scLIGHT-RBD序列模块在表5bSEQIDNO:40中示出。优选的构象LIGHT-Fc此外，该融合多肽包括根据SEQIDNO:13的抗体Fc片段结构域，所述抗体Fc片段结构域通过根据SEQIDNO:16的铰链接头在C末端上融合至可溶性LIGHT结构域(v)。发明人惊奇地发现，与二价激动性抗LIGHT-受体-mAB相比，该特定融合多肽提供了改善的生物活性，并且与包括位置223中的赖氨酸和CH2结构域N297S突变(根据EU编号)的类似融合蛋白相比具有延长的稳定性。本发明的LIGHT受体激动剂蛋白的示例性实施方式的氨基酸序列在SEQIDNO:27中所示。此外，融合多肽可包括N末端信号肽结构域，例如根据SEQIDNO:17的N末端信号肽结构域。本发明的LIGHT受体激动剂蛋白的具体实例在SEQIDNO:25中示出。根据另一个优选实施方式，该融合多肽可另外包括C末端Strep标签，所述C末端Strep标签经由SEQIDNO:18中所示的短的丝氨酸接头而被融合至本发明的多肽。根据本发明的这一方面，Fc片段优选由SEQIDNO:13或14中所示的氨基酸序列组成。进一步地，Fc片段可以由较短的Fc片段组成，例如包括SEQIDNO:13的氨基酸1-217Fc片段。包括C末端Strep标签的融合多肽的特别优选的实例示于SEQIDNO:15(蛋白A)。如SEQIDNo:15、25和26所示的示例性LIGHT受体激动剂蛋白，各自在每个序列的氨基酸1-20处包括N末端信号肽结构域。在每种情况下，成熟蛋白以氨基酸21开始。本发明成熟的示例性LIGHT受体激动剂蛋白(没有信号肽)在SEQIDNO:27-35中所示。上文所述的示例性LIGHT受体激动剂蛋白示于表5中。如在SEQIDNO:27中所示的LIGHT受体激动剂的糖基化位点的总数减少(根据EU编号系统，N297S突变在CH2区中提供了无糖基化的CH2结构域)、铰链区中链间二硫键的数目增加，以及上铰链赖氨酸至甘氨酸的突变(根据EU编号系统，K223G)。另外，第二肽接头(iv)是缩短的，模块(iii)和(v)是N末端缩短的，由此降低了所有原体解离并增强了蛋白质对蛋白酶的稳定性。这些改变提供了减少潜在的降解和LIGHT受体超簇(伴随有伴随的毒性)。如在SEQIDNO:30中所示的LIGHT受体激动剂包括与SEQIDNO:27相同的布局，但在可溶性LIGHT结构域(i)中具有E91Q突变，由此能够形成焦谷氨酸，导致保护了N末端免受氨肽酶影响，并随后增强了制造和储存期间蛋白质的整体稳定性。如在SEQIDNO:32所示的LIGHT受体激动剂包括与SEQIDNO:30相同的布局，但具有缩短的第三肽接头(vi)以减少可溶性LIGHT结构域(v)和Fc结构域(Vii)之间的结构域间距离，由此增强了蛋白质对蛋白酶的稳定性。根据本发明的一种实施方式，单链LIGHT融合多肽结构域包括如在SEQIDNO:39中所示的scLIGHT-RBD模块，任选地具有包括E91Q突变的可溶性结构域(i)。在SEQIDNO:30中示出了本发明的LIGHT受体激动剂蛋白的具体实例，其包括结构域(i)中的E91Q突变蛋白、SEQIDNO:16的铰链接头和根据SEQIDNO:13的抗体Fc片段。表5：示例性LIGHT受体激动剂蛋白表5B：示例性scLIGHT-RBD模块此外，已注意到，scLIGHT-RBD模块(SEQIDNO:36、39和SEQIDNO:40)非常适合于生成具有其他结构域的融合蛋白，该其他结构域采用在表2中所述的接头(SEQIDNO：2-12)融合到或N末端或C末端端部。本发明的LIGHT受体激动剂蛋白的上述实施方式解决了本发明的可溶性受体激动剂蛋白的影响构建原则的稳定性或聚集抗性，或调节受体激动剂蛋白的受体结合和活性。用于描述在医药制剂中作为活性剂的物质的适用性的另一重要特性是其药物代谢动力学谱(pharmacokineticprofile)(PK谱)。药物代谢动力学是研究药物在身体内的分布并关注药物血浆浓度的变化。对于任何给定的药物和剂量，血浆浓度将根据吸收、分配和消除的过程而变化。血浆药物浓度以及其从身体的最终消除对时间的依赖性下降主要取决于药物的生物转化和排泄，通常以体内半衰期来测量(Pharmacology,4thEdition；Elesevier2013)。理解组成针对病原体或肿瘤的免疫应答的事件过程，这允许测定本发明的LIGHT受体激动剂蛋白的有利的PK谱。针对病原体或确实携带抗原的肿瘤的免疫应答可分为若干个阶段。每个阶段都显示了特征持续时间，并且事件通常发生在特定的组织中。特别地，启动阶段描述了在次级淋巴器官中淋巴细胞呈递肿瘤相关抗原时免疫应答中的早期事件。为了通过其T细胞或B细胞受体识别抗原，T细胞和B细胞分别需要与抗原呈递细胞(APC)形成细胞-细胞缀合物。在成功进行抗原识别的情况下，淋巴细胞也被APC呈递出共刺激分子，诸如LIGHT。由于抗原和共刺激分子两者的呈递都发生在APC/淋巴细胞缀合物的界面处，所以这种相互作用相当短暂，因为缀合物在若干分钟或几小时后分离。在抗原识别和与分子诸如LIGHT共刺激之后，淋巴细胞被激活并进入扩增阶段，在扩增阶段期间它们增殖以便产生针对肿瘤的免疫应答。鉴于APC和淋巴细胞在次级淋巴器官中短的物理相互作用，可以推测由靶向LIGHT受体途径的重组生物制剂引发的共刺激信号期望是短寿命的。事实上，长时间暴露于共刺激信号可能会推动淋巴细胞进入高度活化状态，可能导致全身毒性效应。因此，用于靶向免疫系统的共刺激途径的生物制剂的良好PK谱将显示在数小时或可能一天的范围内相对短的终末半衰期。这将与靶向相同途径的抗体形成对比，该抗体通常显示出多天甚至多于一周的终末半衰期。总之，激活免疫系统的共刺激途径的生物制剂具有几个小时的半衰期，这与刺激抗体相比就其时间活性(temporalactivity)而言更接近天然配体。这也可以对在用某些免疫刺激抗体治疗期间观察到的可能毒性作用作出积极贡献。因此，在另一种实施方式中，本发明的LIGHT受体激动剂蛋白具有短的终末半衰期，诸如少于4天、少于三天、少于两天、少于一天。本发明的另一方面涉及编码本文所述的LIGHT受体激动剂蛋白的核酸分子。核酸分子可以是DNA分子，例如双链或单链DNA分子，或RNA分子。核酸分子可编码LIGHT受体激动剂蛋白或其前体，例如LIGHT受体激动剂蛋白的原形式或前形式，其可包括用于分泌或纯化的信号序列或其他异源氨基酸部分，其优选位于LIGHT受体激动剂蛋白的N末端和/或C末端。异源氨基酸部分可以通过蛋白酶切割位点，例如因子X3、凝血酶或IgA蛋白酶切割位点连接至第一和/或第二结构域。本发明的核酸序列的具体实例示于表6中为SEQIDNO:37。该核酸分子包括编码SEQIDNO:25的融合多肽的开放阅读框。表6：示例性LIGHT受体激动剂蛋白的核酸序列核酸分子可操作性地连接到表达控制序列，例如允许核酸分子在所需宿主细胞中表达的表达控制序列。核酸分子可以位于载体上，例如质粒、细菌噬菌体、病毒载体、染色体整合载体等。合适的表达控制序列和载体的实例描述于例如由Sambrook等人(1989)MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,andAusubel等人(1989),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons或其更新的版本。各种表达载体/宿主细胞系统可用于表达编码本发明的LIGHT受体激动剂蛋白的核酸序列。合适的宿主细胞包括但不限于原核细胞，诸如细菌，例如大肠杆菌(E.coli)，真核宿主细胞，诸如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞，优选哺乳动物细胞，更优选人细胞。此外，本发明涉及用如上所述的核酸分子转化或转染的非人生物。这种转基因生物可以通过已知的遗传转移方法产生，包括同源重组。本发明的另一方面涉及药物或诊断组合物，其包括作为活性剂的至少一种LIGHT受体激动剂蛋白、编码它们的相应核酸或转化或转染的细胞，全部如本文所述的。另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括本文公开的LIGHT受体激动剂蛋白和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。另一方面，本发明提供编码LIGHT受体激动剂蛋白的核酸分子。在另一种实施方式中，本发明提供了包括核酸分子的表达载体。在另一种实施方式中，本发明提供了包括该核酸分子的细胞。在进一步的实施方式中，该细胞是真核细胞。在另一种实施方式中，该细胞是哺乳动物细胞。在另一种实施方式中，该细胞是中国仓鼠卵巢(CHO-1)细胞。在其他实施方式中，细胞选自由CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S和CHO-K1细胞组成的组。在其他实施方式中，该细胞选自由Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NS0、CRL7030、HsS78Bst、PER.C6、SP2/0-Agl4和杂交瘤细胞。在另一方面，本发明提供了治疗患有LIGHT相关疾病或疾患的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的LIGHT受体激动剂蛋白。在一种实施方式中，单独施用LIGHT受体激动剂蛋白。在另一种实施方式中，LIGHT受体激动剂蛋白在施用第二种药剂之前、同时或之后施用。在另一种实施方式中，所述疾病或疾患选自有如下组成的组：肿瘤、传染病、炎性疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病、退行性疾病、凋亡相关疾病和移植排斥。在一种实施方式中，肿瘤是实体肿瘤。在一种实施方式中，肿瘤来源于由肉瘤、食管癌和胃癌组成的癌症组。在另一种实施方式中，肿瘤源自尤氏文肉瘤(Ewing’ssarcoma)或纤维肉瘤。在另一种实施方式中，肿瘤来源于由非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌和小细胞肺癌(SCLC)组成的癌症组。在一种实施方式中，肿瘤是淋巴肿瘤。在一种实施方式中，肿瘤是血液肿瘤。在另一种实施方式中，肿瘤源自非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)、白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或毛细胞白血病。在另一种实施方式中，自身免疫疾病是类风湿性疾病、关节炎疾病或类风湿性和关节炎疾病。在另一种实施方式中，疾病或疾患是类风湿性关节炎。在另一种实施方式中，退行性疾病是神经退行性疾病。在另一实施方式中，神经退行性疾病是多发性硬化。在一种实施方式中，第二剂是化疗剂、放射治疗剂或生物剂。在一种实施方式中，第二药剂选自由度维利塞(Duvelisib)、伊布替尼(Ibrutinib)、纳维妥拉(Navitoclax)和维奈妥拉(Venetoclax)组成的组，在另一种实施方式中，第二种剂是凋亡剂。在一种实施方式中，凋亡的第二剂选自由硼替佐米(Bortezomib)、氮杂胞苷(Azacitidine)、达沙替尼(Dasatinib)和吉非替尼(Gefitinib)组成的组。在一种具体实施方式中，通过静脉内或皮下施用将本文公开的药物组合物施用于患者。在其他实施方式中，通过口内、胃肠外、肌内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、团注(bolus)、阴道内、直肠、口腔的、舌下的、鼻内或透皮施用将所公开的药物组合物施用于患者。在一种实施方式中，LIGHT受体激动剂蛋白作为单次团注施用。在另一种实施方式中，LIGHT受体激动剂蛋白可以分若干次的剂量施用。LIGHT受体激动剂蛋白可以约0.1-100mg/kg施用。在一种实施方式中，LIGHT受体激动剂蛋白可以选自以下项组成的组的剂量施用：约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-15、1-7.5、1.25-15、1.25-7.5、2.5-7.5、2.5-15、5-15、5-7.5、1-20、1-50、7-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75和10-100mg/kg。在其他实施方式中，LIGHT受体激动剂蛋白以约0.1-100mg/ml存在于药物组合物中。在一种实施方式中，所述LIGHT受体激动剂蛋白以选自以下项组成的组的量存在于药物组合物中：约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-20、1-50、1-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100mg/ml。在其他实施方式中，将治疗有效量的LIGHT受体激动剂蛋白施用于受试者。在另一种实施方式中，将预防有效量的LIGHT受体激动剂蛋白施用于受试者。本文所用术语“LIGHT相关疾病或疾患”是可通过向需要其的受试者施用有效量的LIGHT受体激动剂而可以改善的任何疾病或疾患。至少一种LIGHT受体激动剂蛋白、相应的编码其的核酸或转化或转染的细胞，全部如本文所述的可用于治疗，例如预防和/或治疗由LIGHT功能障碍引起的、与LIGHT功能障碍相关的和/或伴随LIGHT功能障碍的疾患，特别是增殖性疾病，诸如肿瘤，例如实体肿瘤或淋巴肿瘤；传染病；炎性疾病；代谢性疾病；自身免疫性疾病，例如类风湿性和/或关节炎疾病；退行性疾病，例如神经退行性疾病，诸如多发性硬化；凋亡相关疾病或移植排斥。本文所用的术语“LIGHT功能障碍”应理解为LIGHT的任何功能或表达偏离LIGHT的正常功能或表达，例如LIGHT基因或蛋白的过度表达、与LIGHT的正常生理表达水平相比LIGHT基因或蛋白的表达减少或消除、与LIGHT正常的生理活性或结合相比，LIGHT活性增加、LIGHT活性降低或消除、LIGHT与任何结合配偶体(例如，受体，特别是LIGHT受体或另一细胞因子分子)的结合增强、与任何结合配偶体(例如受体，特别是LIGHT受体或另一细胞因子分子)的结合减弱或消除。在各种实施方式中，提供了一种用于治疗患有可通过靶向LIGHT受体治疗的疾患的人受试者的方法，所述方法包括向人受试者施用本文公开的LIGHT受体激动剂蛋白，使得对人受试者中的一种或多种靶标的活性的影响是激动性的，使得一种或多种症状减轻和/或使得治疗实现。本文提供的LIGHT受体激动剂蛋白可用于治疗患有原发性和转移性癌症的人，包括乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌(例如小细胞肺癌“SCLC”和非小细胞肺癌“NSCLC”)、口咽癌、下咽癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊和胆管癌、小肠癌、尿道癌(包括肾癌、膀胱癌和尿路上皮癌)、女性生殖道癌(包括宫颈癌、子宫癌和卵巢癌以及绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)、男性生殖道癌(包括前列腺癌、精囊癌、睾丸癌和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺癌(包括甲状腺癌、肾上腺癌和垂体癌)和皮肤癌，以及血管瘤、黑色素瘤、肉瘤(包括源自骨和软组织的肉瘤以及卡波西肉瘤(Kaposi’ssarcoma))、脑肿瘤、神经肿瘤、眼睛肿瘤和脑膜肿瘤(包括星形细胞瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、许旺氏细胞瘤(Schwannomas)和脑膜瘤)、源自造血系统恶性肿瘤、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’sandnon-Hodgkin’slymphomas)、DLBCL、滤泡性淋巴瘤、造血系统恶性肿瘤、卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增生症、恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤、副肿瘤综合征/恶性高钙血症或实体肿瘤。提供了包括本文公开的LIGHT受体激动剂蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物包括至少一种用于治疗疾患的另外的治疗剂。例如，另外的剂可以是治疗剂、化疗剂；成像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)、共刺激分子调节剂或免疫检查点抑制剂(包括但不限于抗B7.1、抗B7.2、抗B7.3、抗B7.4、抗CD28、抗B7RP1、CTLA4-Ig、抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗ICOS、抗LAG-3、抗Tim3、抗VISTA、抗HVEM、抗BTLA、LIGHT融合蛋白、抗CD137、抗CD137L、抗OX40、抗OX40L、抗CD70、抗CD27、抗GAL9、抗A2AR、抗KIR、抗IDO-1、抗CD20)、树突状细胞/抗原呈递细胞调节剂(包括但不限于抗CD40抗体、抗CD40L、抗DC-SIGN、抗Dectin-1、抗CD301、抗CD303、抗CD123、抗CD207、抗DNGR1、抗CD205、抗DCIR、抗CD206和抗ILT7)、Toll样受体调节剂(包括但不限于抗TLR-1、抗TLR-2、抗TLR-3、抗TLR-4、抗TLR-4、抗TLR-5、抗TLR-6、抗TLR-7、抗TLR-8、抗TLR-9)、粘附分子阻滞剂(包括但不限于抗LFA-1抗体、抗E/L选择素抗体、小分子抑制剂)、抗细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于抗IL-18、抗TNF或抗IL-6/细胞因子受体抗体)、双特异性重定向T细胞或NK细胞细胞毒性(包括但不限于)、基于嵌合T细胞受体(CAR-T)治疗、基于T细胞受体(TCR)治疗、治疗性癌症疫苗、甲氨蝶呤(methotrexate)、环孢菌素(methotrexate)、雷帕霉素(methotrexate)、FK506、可检测标记物或报告物、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、麻醉剂、非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗菌剂、抗银屑病剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。在一种实施方式中，治疗癌症或预防或抑制本文所述肿瘤转移的方法中，一种或多种LIGHT受体激动剂蛋白可单独使用或与一种或多种另外的剂例如化疗剂、放疗剂或生物剂组合使用。在一些实施方式中，该剂可以包括如下：13-顺式视黄酸(13-cis-RetinoicAcid)；2-CdA；2-氯脱氧腺苷(2-Chlorodeoxyadenosine)；5-氮杂胞苷(5-Azacitidine)；5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)；5-FU；6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine)；6-MP；6-TG；6-硫鸟嘌呤(6-Thioguanine)；白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)；放线菌素-D(Actinomycin-D)；阿地白介素(Aldesleukin)：阿仑单抗(Alemtuzumab)；ALIMTA；阿里维A酸(Alitretinoin)；奥卡班全反式维甲酸(All-transretinoicAcid)；α干扰素(AlphaInterferon)；六甲蜜胺(Altretamine)；氨甲蝶呤(Amethopterin)；氨磷汀(Amifostine)；氨鲁米特(Aminoglutethimide)；阿那格雷(Anagrelide)；阿那曲唑(Anastrozole)；阿拉伯糖基胞嘧啶(Arabinosylcytosine)；Ara-C(Ara-C)；三氧化二砷(ArsenicTrioxide)；阿泽拉TM(Arzerra)；天冬酰胺酶(Asparaginase)；ATRA；阿扎胞苷(Azacitidine)；BCG；BCNU；苯达莫司汀(Bendamustine)；贝伐单抗(Bevacizumab)；贝沙罗汀(Bexarotene)；必卡他胺(Bicalutamide)；BiCNU；博来霉素(Bleomycin)；硼替佐米(Bortezomib)；白消安(Busulfan)；C225；甲酰四氢叶酸钙(CalciumLeucovorin)；喜树碱11(Camptothecin-11)；卡培他滨(Capecitabine)喀拉克TM(Caraci)；卡铂(Carboplatin)；卡莫司汀(Carmustine)；卡莫司汀膜晶片(CarmustineWafer)；CC-5013；CCI-779；CCNU；CDDP；CeeNU；西妥昔单抗(Cetuximab)；苯丁酸氮芥(Chlorambucil)；顺铂(Cisplatin)；嗜橙菌因子(CitrovorumFactor)；克拉屈滨(Cladribine)；可的松(Cortisone)；CPT-11；环磷酰胺(Cyclophosphamide)；阿糖孢苷(Cytarabine)；阿糖孢苷脂质体(CytarabineLiposomal)；赛德萨达卡巴嗪(Dacarbazine)；达克金(Dacogen)；更生霉素(Dactinomycin)；阿法达贝泊汀(DarbepoetinAlfa)；达沙替尼(Dasatinib)；道诺霉素(Daunomycin)；道诺红菌素(Daunorubicin)；道诺红菌素盐酸盐(DaunorubicinHydrochloride)；道诺红菌素脂质体(DaunorubicinLiposomal)；地卡特隆(Decadron)；地西他滨(Decitabine)；地尼白介素-毒素连接物(DenileukinDiftitox)；戴破赛TM(DepoCytk)；地塞米松(Dexamethasone)；地塞米松乙酸盐(DexamethasoneAcetate)；地塞米松钠磷酸盐(DexamethasoneSodiumPhosphate)；戴克赛松(Dexasone)；右雷佐生(Dexrazoxane)；DHAD；DIC；笛奥戴克(Diodex)；多西他赛(Docetaxel)；阿霉素(Doxorubicin)；阿霉素脂质体(DoxorubicinLiposomal)；得罗希亚TM(DroxiaTM)；DTIC；度维里斯(Duvelisib)；艾里咖TM(Eligardi)；意林司TM(Ellencei)；乐沙定TM(Eloxatinb)；表柔比星(Epirubicin)；阿法依泊汀(EpoetinAlfa)；爱必妥(Erbitux)；埃罗替尼(Erlotinib)；欧文氏菌左旋天冬酰胺酶(ErwiniaL-asparaginase)；雌莫司汀(Estramustine)；阿米福汀(Ethyol)依托泊苷(Etoposide)；磷酸依托泊苷(EtoposidePhosphate)；依维莫司(Everolimus)；依西美坦(Exemestane)；弗隆非格司亭(Filgrastim)；氟尿苷(Floxuridine)；氟达拉滨(Fludarabine)；氟尿嘧啶(Fluorouracil)；氟尿嘧啶乳(膏)(Fluorouracil(cream))；氟甲睾酮(Fluoxymesterone)；氟他胺(Flutamide)；亚叶酸(FolinicAcid)；氟维司群(Fulvestrant)；吉非替尼(Gefitinib)；吉西他滨(Gemcitabine)；吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumabozogamicin)；健择(Gemzar)；格列卫TM(Gleevecm)；卡莫植入膜剂(Wafer)；GM-CSF；戈舍瑞林(Goserelin)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(Granulocyte-ColonyStimulatingFactor)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-MCSF)(GranulocyteMacrophageColonyStimulatingFactor)；海赛卓尔(Hexadrol)；六甲嘧胺(Hexamethylmelamine)；HMM；(Hydrocort)；氢化可的松(Hydrocortisone)；氢化可的松磷酸钠(HydrocortisoneSodiumPhosphate)；氢化可的松琥珀酸钠(HydrocortisoneSodiumSuccinate)；磷酸氢化可的松(HydrocortonePhosphate)；羟基脲(Hydroxyurea)；依鲁替尼(Ibrutinib)；替伊莫单抗(Ibritumomab)；替坦异贝莫单抗(IbritumomabTiuxetan)；伊达比星(Idarubicin)干扰素α(Interferon-alpha)；干扰素α；干扰素α-2b(PEG缀合物)(Interferon-alpha-2b(PEGConjugate))；异环磷酰胺(Ifosfamide)；白介素11(IL-11)(Interleukin-11)；白介素2(IL-2)(Interleukin-2)；甲磺酸伊马替尼(Imatinibmesylate)；咪唑甲酰胺(ImidazoleCarboxamide)；(Intron)；伊匹单抗(ipilimumab)、伊立替康(Irinotecan)；异维甲酸(Isotretinoin)；伊沙匹隆(Ixabepilone)；伊赛普拉TM(Ixempral)；凯卓酶(t)(Kidrolase(t))拉帕替尼(Lapatinib)；L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)；LCR；来那度胺(Lenalidomide)；来曲唑(Letrozole)；甲酰四氢叶酸(Leucovorin)；留可然(Leukeran)；瘤肯TM(Leukinen)；亮丙瑞林(Leuprolide)；长春新碱(Leurocristine)；禄斯得停TM(Leustatint)；利丽单抗(Lirilumab)；阿糖胞苷脂质体(LiposomalAra-C)；(Liquid)；罗氮芥(Lomustine)；L-PAM；左旋苯丙氨氮芥(L-Sarcolysin)；(Lupron)；马希得克(Maxidex)；双氯乙基甲胺(Mechlorethamine)；盐酸双氯乙基甲胺(MechlorethamineHydrochloride)；甲地孕酮(Megestrol)；醋酸甲地孕酮(MegestrolAcetate)；MEK抑制剂(MEKinhibitor)；美法仑(Melphalan)；巯基嘌呤(Mercaptopurine)；美司钠(Mesna)；美司那TM(MesnexTM)；甲氨蝶呤(Methotrexate)；甲氨蝶呤钠(MethotrexateSodium)；甲基强的松龙(Methylprednisolone)；丝裂霉素(Mitomycin)；丝裂霉素C(Mitomycin-C)；米托蒽醌；(Mitoxantrone)；MTC；MTX；盐酸氮芥氮芥(Mustine)；麦乐赛尔TM(MylocelTM)；生根粉263(Navitoclax)；奈拉滨(Nelarabine)；倍血添TM(Neulastan)；尼罗替尼(Nilotinib)；尼鲁米特(Nilutamide)；氮芥(NitrogenMustard)；纳武单抗(Nivolumab)；尼普累特(Nplate)；奥曲肽(Octreotide)；醋酸奥曲肽(Octreotideacetate)；奥法木单抗(Ofatumumab)；昂克赛尔TM(Onxal尔)；奥普瑞白介素(Oprelvekin)；奥沙利铂(Oxaliplatin)；紫杉醇(Paclitaxel)；紫杉醇蛋白质结合物(PaclitaxelProtein-bound)；帕米膦酸钠(Pamidronate)；帕尼单抗(Panitumumab)；帕唑帕尼(Pazopanib)；PEG干扰素(PEGInterferon)；培加帕加司(Pegaspargase)；培非格司亭(Pegfilgrastim)；PEG-INTRONt；PEG左旋天冬酰胺酶(PEG-L-asparaginase)；PEMETREXED；派姆单抗(Pembrolizumab)；喷司他丁(Pentostatin)；帕妥珠单抗(Pertuzumab)；苯丙氨酸氮芥(PhenylalanineMustard)；皮地利珠单抗(Pidilizumab)；普拉汀诺泼尼松龙(Prednisolone)；泼尼松(Prednisone)；甲基苄肼(Procarbazine)；聚苯丙生20载卡莫司汀植入剂(Prolifeprospan20withCarmustineImplant)；BRAF抑制剂(BRAFinhibitor)；雷洛昔芬(Raloxifene)；利妥昔单抗(Rituximab)；罗米司亭(Romiplostim)；盐酸红比霉素(Rubidomycinhydrochloride)；善得定(Sandostatin)；沙格司亭(Sargramostim)；索拉非尼(Sorafenib)；SPRYCELi；STI-571；STIVAGRAb；链脲菌素(Streptozocin)；SU11248；舒尼替尼(Sunitinib)；它莫西芬(Tamoxifen)替莫唑胺(Temozolomide)替西罗莫司(Temsirolimus)；替尼泊苷(Teniposide)；TESPA；萨力多胺(Thalidomide)；硫鸟嘌呤(Thioguanine)；(Thioguanine)；三胺硫磷(Thiophosphoamide)；硫替哌(Thiotepa)；拓扑替康(Topotecan)；托瑞米芬(Toremifene)；托西莫单抗(Tositumomab)；曲妥珠单抗(Trastuzumab)；曲美木单抗(Tremelimumab)；维甲酸(Tretinoin)；曲克傲TM(TrexallTM)；TSPA；乌瑞鲁单抗(Urelumab)；VCR；维克替比TM(VectibixTM)；万耐托克(Venetoclax)；微尔度TM(ViadurTM)；长春花碱(Vinblastine)；硫酸长春花碱(VinblastineSulfate)；万卡赛(Vincasar)；长春新碱(Vincristine)；长春瑞滨(Vinorelbine)；酒石酸长春瑞滨(Vinorelbinetartrate)；VLB；VM-26；伏立诺他(Vorinostat)；福退癌(Votrient)；VP-16；泽娃灵TM唑来膦酸(Zoledronicacid)；佐林扎(Zolinza)；或和/或本文未具体列出的靶向相似途径的任何其他剂。当两种或更多种物质或原理用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径、在基本上相同的时间或在不同的时间(例如基本上同时、连续或根据替换方案)施用。当物质或原理通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或组合药物制剂或组合物的一部分施用，这对于本领域技术人员来说是清楚的。此外，当两种或更多种活性物质或原理用作组合治疗方案的一部分时，每种物质或原理可以以与化合物或原理单独使用时相同的量和根据相同的方案施用，并且这种组合使用可以产生或可以不产生协同效应。然而，当两种或更多种活性物质或原理的组合使用导致协同效应时，也可以减少一种、多于一种或所有待施用的物质或原理的量，而仍然实现期望的治疗作用。当它们以通常的量使用时，这可以例如用于避免、限制或减少与一种或多种物质或原理的使用相关的任何不希望的副作用，同时仍然获得期望的药物或治疗效果。根据本发明使用的治疗方案的有效性可以以对于所涉及的疾病或疾患本身已知的任何方式来确定和/或遵循，如对于临床医生来说将是清楚的。临床医生还能够在适当的情况下并在个案的基础上改变或修改特定的治疗方案，以便实现期望的治疗效果，避免、限制或减少不期望的副作用，和/或在一方面实现期望的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不期望的副作用之间实现适当的平衡。通常，将遵循治疗方案直到获得期望的治疗效果和/或只要维持期望的治疗效果。同样，这可以由临床医生确定。在各种实施方式中，本文提供了包含一种或多种LIGHT受体激动剂蛋白的药物组合物，其是单独的或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的。在各种实施方式中，本文公开的药物组合物的用途的非限制性实例包括诊断、检测和/或监测疾患，预防、治疗、管理和/或改善疾患或其一种或多种症状和/或用于研究。单独的或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的药物组合物的制剂，是本领域技术人员已知的(美国专利公开No.20090311253A1)。如本文所用，短语“有效量”是指导致与LIGHT功能障碍相关的或与LIGHT相关的疾病或疾患相关的一个或多个参数的可检测的改善(例如，高于基线至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或更多)的LIGHT激动剂蛋白的量。施用本文提供的治疗剂的方法包括但不限于口服施用、胃肠外施用(例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外施用、瘤内施用、粘膜施用(例如鼻内和口服途径)和肺部施用(例如用吸入器或喷雾器施用的雾化化合物)。用于特定施用途径的药物组合物的制剂以及各种施用方法所必需的材料和技术对于本领域技术人员是可获得的和已知的(美国专利公开No.20090311253A1)。在各种实施方式中，可以调节剂量方案以提供最佳所需应答(例如，治疗或预防应答)。例如，可以单次团注施用，可以随时间施用若干个分开的剂量，或者剂量可以按治疗情况的紧急指示成比例地减少或增加。在一些实施方式中，胃肠外组合物以剂量单位形式配制，以便于施用和剂量的均匀性。术语“剂量单位形式”是指适于作为待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单元含有预定量的活性化合物，所述预定量的活性化合物经计算以产生与所需药物载体相关的所需治疗效果。本文提供的治疗或预防有效量的LIGHT受体激动剂蛋白的示例性非限制性范围为约0.1-100mg/kg(例如，约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-15、1-7.5、1.25-15、1.25-7.5、2.5-7.5、2.5-15、5-15、5-7.5、1-20、1-50、7-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100mg/kg，或中间的任何浓度)。在一些实施方式中，所述LIGHT受体激动剂蛋白以治疗有效浓度存在于药物组合物中，例如约0.1-100mg/ml的浓度(例如，0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-20、1-50、1-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100mg/ml，或中间的任何浓度)。注意，剂量值可随待缓解病症的类型和/或严重程度而变化。还应当理解，对于任何特定的受试者，可以根据个体需要和/或进行组合物施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间调节具体的剂量方案，并且本文所示的剂量范围仅是示例性的，而不旨在限制所要求保护的组合物的范围或实践。实施例实施例1.LIGHT受体激动剂蛋白制备A)氨基酸Met1–Gly20Ig-κ-信号肽，在氨基酸Gly20之后假定的信号肽酶切割位点。B)氨基酸Glu21–Val170人LIGHT的第一可溶性细胞因子结构域(LIGHT，SEQIDNO:1的氨基酸91-240)。C)氨基酸Gly171–Ser178SEQIDNO:2的第一肽接头元件。D)氨基酸Pro179–Val325人LIGHT的第二可溶性细胞因子结构域(LIGHT，SEQIDNO:1的氨基酸94-240)。E)氨基酸Gly326–Ser329。SEQIDNO:11的第二肽接头元件。F)氨基酸Pro330–Val476人LIGHT配体的第三可溶性细胞因子结构域(LIGHT，SEQIDNO:1的氨基酸94-240)。G)氨基酸Gly477–Cys497SEQIDNO:16的铰链接头元件。H)氨基酸Pro498–Lys715SEQIDNO:13的抗体Fc片段结构域。上述LIGHT受体激动剂蛋白如SEQIDNO:25所示。所示的接头可由其他优选的接头替换，例如如SEQIDNO:3-12所示。所示的铰链连接元件可由其他优选的铰链连接元件替代，例如如SEQIDNO:19-24中所示。应当注意，第一和第二肽接头不需要相同。信号肽序列(A)可以被任何其他合适的例如哺乳动物信号肽序列替换。1.2编码该多肽的基因盒合成基因可以根据用于在合适的宿主细胞例如昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达的其密码子使用而优化。优选的核酸序列如SEQIDNO:37所示。实施例2.表达和纯化2.1融合多肽的克隆、表达和纯化上述融合蛋白使用下述方法在两种不同真核宿主细胞中重组表达：小规模表达LIGHT受体激动剂融合蛋白的方法：为了初步分析前述LIGHT受体激动剂融合蛋白，Hek293细胞在补充有10％的FBS，100单位/ml青霉素和100[mu]g/ml链霉素的DMEM+GlutaMAX(GibCo)中生长，用包含融合多肽表达盒和适当选择标志物的质粒瞬时转染，例如是包含杀稻瘟菌素、嘌呤霉素或潮霉素抗性基因的功能表达盒。在需要多个多肽链以获得最终产物的那些情况下，表达盒将在转染过程中结合在一种质粒上或定位在不同质粒上。将在转染后3天收获含有重组融合多肽的细胞培养物上清液，并通过300×g离心澄清，随后通过0.22μm无菌过滤器过滤。大规模表达和纯化LIGHT受体激动剂融合蛋白的方法为了在体内更大规模地表达待使用的LIGHT受体激动剂融合蛋白，将编码上述蛋白质的合成DNA盒插入真核表达载体中，该真核表达载体包括适当的选择标志物(例如，包括杀稻瘟菌素、嘌呤霉素或潮霉素抗性基因的功能表达盒)和适于增加宿主细胞基因组内转录活性插入位点数目的遗传元件。通过电穿孔将序列验证的表达载体导入适合中国仓鼠卵巢细胞(CHO-S，Invitrogen)的悬浮液中。转染后三天将对转染细胞施加合适的选择压力。通过随后在选择压力下培养来回收携带源自于载体的抗性基因的存活细胞。当选择的细胞群在化学限定培养基(PowerCHO2-CD,Lonza)中在37℃和7％CO2气氛中在轨道震荡培养箱(100rpm,50mm震甩)中生长稳定时，通过ELISA测定法检测上述蛋白质来分析单个上清液，并且在蛋白质产生之前在摇动瓶中扩增具有最高比生产率的细胞群(轨道震荡器，100rpm，震甩50mm)。对于实验室规模的蛋白质生产，单个细胞群在化学限定的培养基(PowerCHO2-CD,Lonza)中在37℃和7％CO2气氛中在Wave生物反应器20/50EHT(GE-Healthcare)中培养7-12天。基础培养基为补充有4mMGlutaMAX的PowerCHO2-CD。Wave培养始于活细胞浓度为0.3×10e6至0.4×10e6个细胞/ml，且采用如下设定(对于五升或十升袋)：震荡频率18rpm、震荡角度7°、气流0.2-0.3L/min、7％CO2、36.5℃。在Wave运行期间，向细胞培养物中补料PowerFeedA(Lonza)两次，通常在第2天(20％补料)和第5天(30％补料)。第二次补料后，震荡频率增加至22rpm，震荡角度增加到8°。当细胞活力下降到80％以下时，生物反应器通常在第7天至第12天之间收获。首先，使用手动深度过滤系统(MilliporeMillistakPod，MC0HC0.054m2)澄清培养物上清液。对于带Strep标签的蛋白，添加亲和素至终浓度为0.5mg/L。最后，使用瓶顶过滤器(0.22.2，PES，Corning)将含有LIGHT受体激动剂融合蛋白的培养物上清液无菌过滤，并储存在2-8℃直至进一步处理。为了亲和纯化，将链霉素琼脂糖(StreptactinSepharose)填充至柱(凝胶床2ml)，用15ml缓冲液W(100mMTris-HCl，150mMNaCl，pH8.0)或pH7.4的PBS平衡，并将细胞培养物上清液施于色谱柱，流速约为4ml/min。随后，用15ml缓冲液W洗柱，通过加入7×1ml缓冲液E(100mMTrisHCl，150mMNaCl，2.5mM脱硫生物素，pH8.0)逐步洗脱结合的多肽。替换地，包含2.5mM脱硫生物素的pH7.4PBS可以用于该步骤。可替换地基于链霉素琼脂糖的方法，使用具有固定化蛋白A作为亲和配体的柱和层析系统(GE-Healthcare)进行亲和纯化。选择对融合蛋白的FC结构域具有高亲和力的固相材料：MABSelectSureTM(GEHealthcare)。简而言之，将澄清的细胞培养物上清液加载到在洗涤缓冲液-1(20mMPi，95mMNaCl，pH7.2)中平衡的HiTrapMabSelectSure柱(CV＝5ml)上，其不超过10mg融合蛋白/ml柱-床的加载。用10倍柱体积(10CV)的上述平衡缓冲液洗涤柱子，接着用四倍柱体积(4CV)的洗涤缓冲液-2(20mMPi，95mMNaCl，pH8.0)洗涤以去除宿主细胞蛋白和宿主-细胞DNA。然后用洗脱缓冲液(20mMPi，95mMNaCl，pH3.5)洗脱柱子，洗脱液以多至10个级分收集，每个级分的体积等于柱床体积(5ml)。用等体积的上述洗涤缓冲液-2中和每个级分。在上述亲和层析法过程中，线速度设定为150cm/h并保持恒定。定量洗脱液级分的蛋白量，并通过超滤浓缩峰级分，并通过尺寸排阻层析法(SEC)进一步纯化。采用上述方法，在CHO-S细胞中表达重组LIGHT受体激动剂融合蛋白(蛋白A，SEQIDNO:15和蛋白B，SEQIDNO:31)，并采用亲和层析纯化。在图6中示出了具有不对称接头和缩短的LIGHT结构域的蛋白A(SEQIDNO:15)和具有都被糖基化的对称接头的蛋白质B(参考SEQIDNO:31)的分析尺寸排阻层析。使用TosohTSK凝胶G3000SWxl柱在1260无限HPLC系统上进行SEC。该柱中载入浓度为0.94mg/ml(A)或0.77mg/ml(B)总体积为20μl的蛋白质。流速设定为0.5ml/min。对于蛋白A(图6，A部分)在16.24分钟处观察到单个主峰，对于蛋白B(图6，B部分)在15.84分钟处观察到单个主峰。因此，由于糖基化接头(iv)，蛋白B具有较高的表观分子量。两种蛋白质都仅由AFC制备，表明由于缺乏高溶解度聚集体。蛋白A通过使用内部分子量标准(BioRadSEC标准)可以从相应的保留时间来内推(intrapolate)蛋白A和蛋白B的分子量。为了测定天然条件下纯化的融合多肽的表观分子量，向葡聚糖(Superdex)200柱加载有已知分子量的标准蛋白质。基于标准蛋白质的洗脱体积绘制校准曲线并测定纯化的融合多肽的表观分子量。包括FC结构域的LIGHT受体激动剂融合蛋白一般从葡聚糖200柱洗脱，表观分子量约为160-180kDa，证实Fc结构域对成熟LIGHT受体激动剂融合多肽的同源二聚化。实施例3.温度稳定性的测定评价了蛋白A(scLIGHT-RBD-Fc)在高温下的稳定性。因此，将该蛋白质在指定温度的培养箱中暴露10分钟，然后在冰上冷却。然后使用以下ELISA测定法评估对其受体HVEM的结合活性：用HVEM-Fc包被板。将蛋白A(热处理和未处理的对照)添加到板，然后通过其Strep标签使用StrepTactin-HRP进行检测。未处理的对照的结合活性设为100％。低于100％的值表明对受体的结合活性丧失。浓度为75ng/ml的蛋白A的温度稳定性评价结果在下文总结令人惊讶的是，蛋白A(scLIGHT-RBD-Fc)在暴露于高温时非常稳定。即使在80℃孵育10分钟，也没有观察到结合至受体HVEM的相关降低。实施例4.三价对照蛋白为了比较六价LIGHT受体激动剂融合蛋白和用噬菌体RB69-FOLDON稳定的三价LIGHT-RBD之间的相对结合，如前一部分所述在CHO-S细胞中表达并纯化蛋白X(SEQIDNO:38)。SEC纯化的蛋白在以下实施例中用作对照。蛋白质X(SEQIDNO:38)的序列在表7中示出。蛋白X的氨基酸1-20代表信号肽，并且成熟蛋白质以氨基酸Glu51起始。这种蛋白质由三种相同的多肽组成，每种多肽包括一个可溶性LIGHT结构域(SEQIDNO:1的E91-V240)；通过用柔性接头将噬菌体RB69纤维蛋白(fibritin)的三聚化结构域融合至LIGHT的C末端而稳定此组装。表7：包括信号肽的三价对照蛋白实施例5.通过限制性蛋白酶消化测定LIGHT受体激动剂蛋白质的体外稳定性如实施例1中所述的六价Fc融合蛋白一样，将表达并纯化待研究的所有LIGHT受体激动剂蛋白。该组将包括在CH2结构域中包含N297S突变[根据EU编号系统]和铰链区的LIGHT受体激动剂蛋白，该铰链区能够形成三个二硫桥并且另外缺少上铰链赖氨酸[K223，根据EU编号系统]，其突变为甘氨酸[K223G]。在有限的蛋白酶消化测定中，将在三个二硫化物发挥铰链功能的情况下同时包括N297S突变和K223G突变的前述LIGHT受体激动剂蛋白与呈现在两个二硫化物或三个二硫化物实现铰链区的情况下包括N297S突变但具有K223野生型的LIGHT受体激动剂蛋白进行比较。此外，具有减少至4个氨基酸的第二接头元件(iv)，并且具有缩短的铰链元件(vi)的LIGHT受体激动剂蛋白将被研究。工程化策略(三个二硫化物实现铰链区情况下的N297S与K223G突变结合)和缩短接头元件(iv和vi)二者都对相应分子的稳定性具有潜在影响。本发明的不同LIGHT受体激动性蛋白的稳定性可以通过体外限制的蛋白酶消化解决。对于该分析，将上述LIGHT受体激动剂蛋白与低浓度蛋白酶(例如胰蛋白酶、V8蛋白酶)在不同温度(例如4℃、25℃、37℃)下一起孵育不同时间。随后可以通过不同的方法，如SDS-PAGE，分析型SEC或本领域已知的分析质谱法(例如Nano-RP-HPLC-ESI-MSMS)来测量特定蛋白水解片段随时间的定量及其出现。由于被研究的蛋白质具有大部分共同的序列，随着时间的推移，来自单个蛋白质的特定蛋白水解片段的更快的出现和数量增加可用于判断它们的相对稳定性并将它们相互排序。关于所研究的上述LIGHT受体激动剂蛋白的基于蛋白酶的诱饵动力学，关于其蛋白水解稳定性顺序预期如下：与在铰链区中包括N297S和野生型K223的LIGHT受体激动剂蛋白相比，包含N297S和K223G以及实现铰链区的三个二硫化物的LIGHT受体激动剂蛋白同时具有延长的稳定性。与包括SEQIDNO:16作为铰链接头元件的LIGHT受体激动剂蛋白相比，包含SEQIDNO:21作为铰链接头元件的LIGHT受体激动剂蛋白具有延长的稳定性。实施例6.半衰期测定分子蛋白A由两个通过三个链间二硫键共价连接的多肽组成，并且在铰链接头中包括K223G突变以及Fc区的N297S突变(根据EU编号)，导致CH2结构域的无糖基化。检验纯化的蛋白A在小鼠体中的半衰期。雌性CD1小鼠用1.0mg/kg的蛋白A作为单次静脉团注注射施用。应用前(给药前(pre-dose))以及检验项目施用后最长达312小时收集全血。制备血清并将样品储存在-80℃直至测定血清浓度。使用检测HVEM激动剂的ELISA测定对小鼠血清中蛋白A浓度进行定量，示于表8中。用HVEM-Fc包被板。然后通过使用StrepTactin-HRP的Strep标签来检测特异性结合到其受体HVEM的LIGHT构建体。使用参考蛋白A作为校准和对照样品进行ELISA测定。施用标准浓度的测量数据以创建使用5参数拟合的校准曲线。这使得能够测定相应小鼠血清样品中未知的蛋白A浓度。使用平均血清浓度和用于非区室药物代谢动力学数据分析(SummitResearchServices,Montrose,CO)的药物代谢动力学评估程序PKSolutionsVersion2.0来计算药物代谢动力学参数。PKSolutions是基于Excel的自动化应用，其电脑计算来自浓度-时间数据的药物代谢动力学参数，该浓度-时间数据是分析例如静脉内的或血管外的途径施用之后的生物样品而获得的。PKSolutions计算结果而无需假设任何特定的分区模型。药物代谢动力学评估的结果在表8中总结。表8：CD1小鼠的探索性PK研究结果：1mg/kg蛋白A的单次静脉内剂量。蛋白AT最大(h)0.083C最大(μg/ml)12.8T最终t(h)192C最终(μg/ml)0.141t1/2E(h)36.47t1/2E(d)1.52AUC0-t(μg*h/ml)346AUC0-inf(μg*h/ml)353结果表明，蛋白A在小鼠中具有惊人的36.47小时的短的终末半衰期。这种短的半衰期构成了有利的治疗选择，因为需要与LIGHT受体激动剂蛋白的短的共刺激刺激。实施例7：稳定性/聚集测试单体和聚集体的含量通过实施例2中所述的分析性SEC测定。对于特定目的，在生理pH的含有生理盐浓缩物的缓冲液(例如，pH7.40.9％NaCl；pH7.4PBS)中进行该分析。典型的聚集分析在葡聚糖200柱(GEHealthcare)上进行。该柱分离10至800kDa范围内的蛋白。为了测定天然条件下纯化的融合多肽的表观分子量，向葡聚糖200柱加载已知分子量的标准蛋白。基于标准蛋白的洗脱体积绘制校准曲线，并基于洗脱体积计算未知分子量的纯化融合蛋白的表观分子量。对可溶性非聚集蛋白的SEC分析通常在限定的洗脱体积显示出明显的单个蛋白峰(在280nm或214nm处的OD处测量)。该洗脱体积对应于特定蛋白的表观天然分子量。关于在FC融合蛋白的情况下“单体”的定义，两条多肽链的组装由该蛋白质的FC部分驱动，并且功能单位是由两条链组成的蛋白质。含有两条FC连接的多肽链的该单元在Fc融合蛋白的情况下被定义为“单体”，这与二聚化单链融合多肽无关。如果发生蛋白质聚集，SEC分析显示出具有较低保留体积的额外蛋白质峰。蛋白寡聚物可能用作聚集种子，并且高含量的寡聚物可能导致蛋白质聚集。大分子量的寡聚物和聚集体在葡聚糖200柱的空隙体积中洗脱，并且不能通过SEC对它们的天然分子量进行分析。LIGHT受体激动剂融合蛋白的纯化制剂应优选仅含有限定的单体蛋白和非常少量的寡聚蛋白。特定LIGHT受体激动剂融合蛋白制剂的聚集/寡聚程度基于SEC分析通过分别计算所限定单体和寡聚物/聚集体级分的OD280图的峰面积来测定。基于总峰面积，限定的单体蛋白的百分比计算如下：单体含量[％]＝[单体蛋白的峰面积]/[总峰面积]×100)实施例8：通过QCM分析测定三价和六价LIGHT受体配体构建体的平衡结合常数基于用自动生物传感器系统(AttanaA100)测定的动力学结合数据(k结合和k解离)，计算三价和六价蛋白X和蛋白A的平衡结合常数(KD)。A100允许基于石英晶体微天平(QCM)技术来实时研究分子间的相互作用。为此目的，将人LIGHT受体固定化至羧基活化的QCM芯片的表面。随后，三价或六价蛋白X或蛋白A分别以不同浓度(例如0.5、1、2、5和10μg/ml)用作分析物，用于分析配体-受体结合(k结合)和解离(k解离)的动力学结合数据。分析是实时进行的，并且可以计算相应的KD：KD＝k解离/k结合。QCM分析表明，三价蛋白X与相应的固定化LIGHT受体结合，KD在低nM范围内，预期KD为1-100nm。然而，蛋白A的六价构建体显示出与相应的固定化LIGHT受体的在pM范围内的较高的亲和力，预期KD为1–1000pM。动力学结合数据(k结合和k解离)的共同特征是与三价构建体相比，六价构建体显示更快的k结合。此外，如果与三价配体相比，六价配体通常观察到较慢的解离(k解离)。实施例9:在人乳腺癌细胞和结肠癌细胞中由三价和六价LIGHT受体配体构建体诱导凋亡将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人结肠癌细胞系HT-29与不同浓度(0.1ng/ml和10000nl之间)的蛋白X和蛋白A以及不同量的IFNγ(1-100U/ml)一起孵育。将细胞在IFNγ和蛋白X或蛋白A存在下于37℃孵育24h、48h或72h。在每个时间点收获细胞并处理以进行流式细胞术分析，评估碘化丙啶(PI)与双链核酸诸如DNA的结合和膜联蛋白V的上调。PI的结合和膜联蛋白V上调二者都是诱导凋亡细胞死亡的关键指标。人们期望观察到由蛋白A和蛋白X产生的补充效应，即当与单独用IFNγ或蛋白A或蛋白X孵育的细胞相比时，蛋白A和蛋白X二者都将显著增加PI和膜联蛋白V双阳性细胞群。这种补充效应对于MDA-MB-231和HT-29细胞二者可能适用，但在HT-29细胞的情况下可能更显著。这意味着蛋白X和蛋白A可以在IFNγ存在下驱动某些人癌细胞系凋亡。实施例10：人体外T细胞增殖测定通过阴性选择和磁珠(panT细胞分离试剂盒，MiltenyiBiotec)从健康供体的外周血纯化总T细胞(人)，并用CFSE(CellTraceeCFSE细胞增殖试剂盒，用于流式细胞术，ThermoFisher)染色，并以每孔2×10e6个细胞接种到24孔板中。将细胞单独与培养基，单独与可溶性抗CD3抗体(1μg/ml的克隆OKT3)，与抗CD3抗体加抗CD28抗体(1μg/ml的克隆28.2)或与抗CD3抗体加10、100或1000ng/ml的成熟蛋白A(SEQIDNO:27)分别在37℃孵育5天。在第5天，洗涤细胞并用DAPI(排除死细胞)和特异性抗体染色。用GuavaEasyCyte12流式细胞仪(EMDMillipore)通过流式细胞术测量前向散射(FSC或大小)和CFSE稀释(增殖的测定)的表达。使用FlowJo10.1软件(FlowJo，LLC)对每个样品至少一万个记录的事件进行数据分析。响应细胞的百分比通过使用培养基对照基于前向散射和CFSE确定合适的门限位置来测定。细胞尺寸增大或CFSE水平降低的细胞被标记为响应细胞。来自一个供体的两个生物复制的个体数据示于表“T细胞活化的量化”(下文)。这些结果与其他供体的结果一致。该数据清楚地显示，与单独的抗体刺激相比，用蛋白A体外处理人T细胞增强T细胞活化和增殖。T细胞激活的定量：序列表<110>阿珀吉科吉尼科斯股份公司（ApogenixAG）<120>单链LIGHT受体激动剂蛋白<130>PN18015650P<160>40<170>BiSSAP1.3.6<210>1<211>240<212>PRT<213>智人（Homosapiens）<220><223>LIGHT配体(wt)<400>1MetGluGluSerValValArgProSerValPheValValAspGlyGln151015ThrAspIleProPheThrArgLeuGlyArgSerHisArgArgGlnSer202530CysSerValAlaArgValGlyLeuGlyLeuLeuLeuLeuLeuMetGly354045AlaGlyLeuAlaValGlnGlyTrpPheLeuLeuGlnLeuHisTrpArg505560LeuGlyGluMetValThrArgLeuProAspGlyProAlaGlySerTrp65707580GluGlnLeuIleGlnGluArgArgSerHisGluValAsnProAlaAla859095HisLeuThrGlyAlaAsnSerSerLeuThrGlySerGlyGlyProLeu100105110LeuTrpGluThrGlnLeuGlyLeuAlaPheLeuArgGlyLeuSerTyr115120125HisAspGlyAlaLeuValValThrLysAlaGlyTyrTyrTyrIleTyr130135140SerLysValGlnLeuGlyGlyValGlyCysProLeuGlyLeuAlaSer145150155160ThrIleThrHisGlyLeuTyrLysArgThrProArgTyrProGluGlu165170175LeuGluLeuLeuValSerGlnGlnSerProCysGlyArgAlaThrSer180185190SerSerArgValTrpTrpAspSerSerPheLeuGlyGlyValValHis195200205LeuGluAlaGlyGluGluValValValArgValLeuAspGluArgLeu210215220ValArgLeuArgAspGlyThrArgSerTyrPheGlyAlaPheMetVal225230235240<210>2<211>8<212>PRT<213>成<220><223>接头<400>2GlySerGlySerGlyAsnGlySer15<210>3<211>8<212>PRT<213>人造序列<220><223>接头<400>3GlySerGlySerGlySerGlySer15<210>4<211>8<212>PRT<213>人造序列<220><223>接头<400>4GlyGlySerGlySerGlySerGly15<210>5<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>接头<400>5GlyGlySerGlySerGly15<210>6<211>4<212>PRT<213>人造序列<220><223>接头<400>6GlyGlySerGly1<210>7<211>8<212>PRT<213>人造序列<220><223>接头<400>7GlyGlySerGlyAsnGlySerGly15<210>8<211>8<212>PRT<213>人造序列<220><223>接头<400>8GlyGlyAsnGlySerGlySerGly15<210>9<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>接头<400>9GlyGlyAsnGlySerGly15<210>10<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>接头<400>10GlySerGlySerGlySer15<210>11<211>4<212>PRT<213>人造序列<220><223>接头<400>11GlySerGlySer1<210>12<211>3<212>PRT<213>人造序列<220><223>接头<400>12GlySerGly1<210>13<211>218<212>PRT<213>人造序列<220><223>人IGG1FcN297S<400>13ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro151015LysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCys202530ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp354045TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu505560GluGlnTyrSerSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu65707580HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn859095LysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGly100105110GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu115120125MetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr130135140ProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn145150155160AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe165170175LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn180185190ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr195200205GlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys210215<210>14<211>217<212>PRT<213>人造序列<220><223>人IGG1Fc(wt)<400>14ProAlaProProValAlaGlyProSerValPheLeuPheProProLys151015ProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysVal202530ValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyr354045ValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGlu505560GlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHis65707580GlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLys859095GlyLeuProSerSerIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGln100105110ProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMet115120125ThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrPro130135140SerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsn145150155160TyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeu165170175TyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnVal180185190PheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGln195200205LysSerLeuSerLeuSerProGlyLys210215<210>15<211>729<212>PRT<213>人造序列<220><223>蛋白A(融合至去糖基化（deglyco）Fc的LIGHT配体)<400>15MetGluThrAspThrLeuLeuValPheValLeuLeuValTrpValPro151015AlaGlyAsnGlyGluValAsnProAlaAlaHisLeuThrGlyAlaAsn202530SerSerLeuThrGlySerGlyGlyProLeuLeuTrpGluThrGlnLeu354045GlyLeuAlaPheLeuArgGlyLeuSerTyrHisAspGlyAlaLeuVal505560ValThrLysAlaGlyTyrTyrTyrIleTyrSerLysValGlnLeuGly65707580GlyValGlyCysProLeuGlyLeuAlaSerThrIleThrHisGlyLeu859095TyrLysArgThrProArgTyrProGluGluLeuGluLeuLeuValSer100105110GlnGlnSerProCysGlyArgAlaThrSerSerSerArgValTrpTrp115120125AspSerSerPheLeuGlyGlyValValHisLeuGluAlaGlyGluGlu130135140ValValValArgValLeuAspGluArgLeuValArgLeuArgAspGly145150155160ThrArgSerTyrPheGlyAlaPheMetValGlySerGlySerGlyAsn165170175GlySerProAlaAlaHisLeuThrGlyAlaAsnSerSerLeuThrGly180185190SerGlyGlyProLeuLeuTrpGluThrGlnLeuGlyLeuAlaPheLeu195200205ArgGlyLeuSerTyrHisAspGlyAlaLeuValValThrLysAlaGly210215220TyrTyrTyrIleTyrSerLysValGlnLeuGlyGlyValGlyCysPro225230235240LeuGlyLeuAlaSerThrIleThrHisGlyLeuTyrLysArgThrPro245250255ArgTyrProGluGluLeuGluLeuLeuValSerGlnGlnSerProCys260265270GlyArgAlaThrSerSerSerArgValTrpTrpAspSerSerPheLeu275280285GlyGlyValValHisLeuGluAlaGlyGluGluValValValArgVal290295300LeuAspGluArgLeuValArgLeuArgAspGlyThrArgSerTyrPhe305310315320GlyAlaPheMetValGlySerGlySerProAlaAlaHisLeuThrGly325330335AlaAsnSerSerLeuThrGlySerGlyGlyProLeuLeuTrpGluThr340345350GlnLeuGlyLeuAlaPheLeuArgGlyLeuSerTyrHisAspGlyAla355360365LeuValValThrLysAlaGlyTyrTyrTyrIleTyrSerLysValGln370375380LeuGlyGlyValGlyCysProLeuGlyLeuAlaSerThrIleThrHis385390395400GlyLeuTyrLysArgThrProArgTyrProGluGluLeuGluLeuLeu405410415ValSerGlnGlnSerProCysGlyArgAlaThrSerSerSerArgVal420425430TrpTrpAspSerSerPheLeuGlyGlyValValHisLeuGluAlaGly435440445GluGluValValValArgValLeuAspGluArgLeuValArgLeuArg450455460AspGlyThrArgSerTyrPheGlyAlaPheMetValGlySerSerSer465470475480SerSerSerSerSerGlySerCysAspLysThrHisThrCysProPro485490495CysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPhePro500505510ProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThr515520525CysValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsn530535540TrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArg545550555560GluGluGlnTyrSerSerThrTyrArgValValSerValLeuThrVal565570575LeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSer580585590AsnLysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLys595600605GlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGlu610615620GluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPhe625630635640TyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGlu645650655AsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhe660665670PheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGly675680685AsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyr690695700ThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGlySerSerSerSerSerSer705710715720AlaTrpSerHisProGlnPheGluLys725<210>16<211>21<212>PRT<213>人造序列<220><223>铰链接头<400>16GlySerSerSerSerSerSerSerSerGlySerCysAspLysThrHis151015ThrCysProProCys20<210>17<211>20<212>PRT<213>人造序列<220><223>通用信号肽<400>17MetGluThrAspThrLeuLeuValPheValLeuLeuValTrpValPro151015AlaGlyAsnGly20<210>18<211>15<212>PRT<213>人造序列<220><223>带strep标签的丝氨酸接头<400>18SerSerSerSerSerSerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys151015<210>19<211>20<212>PRT<213>人造序列<220><223>铰链接头<400>19GlySerSerSerSerSerSerSerGlySerCysAspLysThrHisThr151015CysProProCys20<210>20<211>19<212>PRT<213>人造序列<220><223>铰链接头<400>20GlySerSerSerSerSerSerGlySerCysAspLysThrHisThrCys151015Pr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