本发明属于生物制药技术领域，涉及一种冻干原粉，具体涉及一种生物抗衰老IMF冻干原粉的制备方法。
背景技术：
IMF(Immune Metabolic Factors免疫代谢因子,简称IMF)是一类以蛋白质、多肽峰物质为主要成分，并有少量核酸组成的生命活性物质。广泛分布于天然动物、植物细胞中。
目前，已经公开了从天然动物中提取IMF生命活性物质的相关报道，如专利名称：一种生物抗衰制剂的生产工艺(申请号：02127943.8，申请日：2002.11.29)。该专利制备的IMF生物抗衰制剂，虽然具有显著的延长人体寿命之效果，可以通过肌肉注射、静脉注射和皮下缓释控释包埋等使用方法，达到延长人体寿命的目的；但该专利方法获得的IMF生命活性物质的分子结构不稳定、分子活性不强等缺陷。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种生物抗衰老IMF冻干原粉的制备方法，该IMF生物抗衰因子，属于绿色、纯天然制品，安全性高。并且可以通过注射、口服、化妆品方式应用于人体，发挥其生物抗衰作用。IMF生命活性物质其分子结构更加稳定、分子活性更强、生物抗衰老作用更全面。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种生物抗衰老IMF冻干原粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)将初生哺乳动物用无菌水冲洗干净；
(2)加无热源重蒸生理盐水，高速匀浆；
(3)在-20℃条件下，沉降分离，去掉结缔组织沉淀物；
(4)将上清液，在42℃、PH 4.5条件下，用4000单位/kg胰蛋白酶进行酶解90分钟，得水解液；
(5)将水解液通过分子量50000D膜进行超滤，去掉酶活性未透过物质，得透过液；
(6)将透过液用伯乐S-X3凝胶进行柱层析，用浓度2％磷酸氢二钠洗脱，分别在25～30分钟、45～50分钟分段分别用紫外线吸收方法指示收取蛋白质、多肽峰物质，得IMF峰物质；
(7)将各IMF峰物质混合均匀，用分子烙印技术对IMF峰物质进一步纯化，去除大分子非活性蛋白质，得纯化提取液；
(8)在纯化提取液中加入浓度75％乙醇，在5℃环境中存放过夜；目的在于保存IMF因子生物活性的同时，沉淀出IMF更高生物活性因子。
(9)次日离心收取沉淀物质，冷冻干燥，即得IMF冻干原粉。
进一步地，所述紫外线吸收方法中使用的紫外线吸收剂为0.5％苯并三氮唑。
所述步骤(7)具体步骤如下：
a、模版IMF多肽MIP制备:
功能单体丙烯酰胺4mmol，模版IMF多肽0.6mmol，溶剂四氢呋喃7mmol，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯37mmol和引发剂偶氮二异丁腈20mg，置于玻璃试管中混和均匀，充氮气，抽出真空排除氧气后密封，60℃水浴恒温，聚合24h，得棒状体聚合物；将其粉碎，用75um筛分，用丙酮反复沉降，取下层粒度相近75um的颗粒，真空干燥，得IMF多肽MIP，备用；
b、高活性IMF多肽的提取:
称取混合均匀的IMF峰物质，与IMF多肽MIP以1:1重量比溶于5V、浓度25％甲醇，搅拌6h，加入20V丙酮，在5℃环境中存放过夜；次日离心收取沉淀物；沉淀物中加入5V、浓度5％冰醋洗脱吸附的IMF多肽，得纯化提取液。
本发明生物抗衰老IMF冻干原粉的制备方法具有以下的有益效果：
1、本发明制备的生物抗衰IMF冻干原粉，可以制成各种剂型，通过注射、口服、化妆品方式应用于人体，具有显著的延长人体寿命之效果，达到延长人体寿命的目的。也可加入食品(饮料、酒)中发挥抗衰老作用。
2、本发明IMF生物抗衰因子，属于绿色、纯天然制品，无毒、无副作用，对人体安全性高。
3、本发明制备的IMF生命活性物质其分子结构更加稳定、分子活性更强、生物抗衰老作用更全面。
4、本发明制备的生物抗衰IMF冻干原粉，工艺简单、原材料来源广泛，生产成本低，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
实施例1
一种生物抗衰老IMF冻干原粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)将初生的羊羔宰杀、去除皮毛及体内垃圾后，用无菌水冲洗干净；
(2)加6倍重量的无热源重蒸生理盐水，以12000rpm高速匀浆；
(3)在-20℃条件下，沉降分离，去掉结缔组织沉淀物；
(4)将上清液，在42℃、PH 4.5条件下，用4000单位/kg胰蛋白酶进行酶解90分钟，得水解液；
(5)将水解液通过分子量50000D膜进行超滤，去掉酶活性未透过物质，得透过液；
(6)将透过液用伯乐S-X3凝胶进行柱层析，用浓度2％磷酸氢二钠洗脱，分别在25～28分钟、45～48分钟分段分别用紫外线吸收方法指示收取蛋白质、多肽峰物质，得IMF峰物质；
(7)将各IMF峰物质混合均匀，用分子烙印技术对IMF峰物质进一步纯化，去除大分子非活性蛋白质，得纯化提取液；
(8)在纯化提取液中加入浓度75％乙醇，在5℃环境中存放过夜；
(9)次日离心收取沉淀物质，冷冻干燥，即得IMF冻干原粉。
进一步地，所述紫外线吸收方法中使用的紫外线吸收剂为0.5％苯并三氮唑。
所述步骤(7)具体步骤如下：
a、模版IMF多肽MIP制备:
功能单体丙烯酰胺4mmol，模版IMF多肽0.6mmol，溶剂四氢呋喃7mmol，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯37mmol和引发剂偶氮二异丁腈20mg，置于玻璃试管中混和均匀，充氮气，抽出真空排除氧气后密封，60℃水浴恒温，聚合24h，得棒状体聚合物；将其粉碎，用75um筛分，用丙酮反复沉降，取下层粒度相近75um的颗粒，真空干燥，得IMF多肽MIP，备用；
b、高活性IMF多肽的提取:
称取混合均匀的IMF峰物质，与IMF多肽MIP以1:1重量比溶于5V、浓度25％甲醇，搅拌6h，加入20V丙酮，在5℃环境中存放过夜；次日离心收取沉淀物；沉淀物中加入5V、浓度5％冰醋洗脱吸附的IMF多肽，得纯化提取液。
实施例2
一种生物抗衰老IMF冻干原粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)将初生的羊羔宰杀，去除皮毛、内脏、体内垃圾后，用无菌水冲洗干净后切碎；
(2)加7倍重量的无热源重蒸生理盐水，以11000rpm高速匀浆；
(3)在-20℃条件下，沉降分离，去掉结缔组织沉淀物；
(4)将上清液，在42℃、PH 4.5条件下，用4000单位/kg胰蛋白酶进行酶解90分钟，得水解液；
(5)将水解液通过分子量50000D膜进行超滤，去掉酶活性未透过物质，得透过液；
(6)将透过液用伯乐S-X3凝胶进行柱层析，用浓度2％磷酸氢二钠洗脱，分别在28～30分钟、45～50分钟分段分别用紫外线吸收方法指示收取蛋白质、多肽峰物质，得IMF峰物质；
(7)将各IMF峰物质混合均匀，用分子烙印技术对IMF峰物质进一步纯化，去除大分子非活性蛋白质，得纯化提取液；
(8)在纯化提取液中加入浓度75％乙醇，在5℃环境中存放过夜；
(9)次日离心收取沉淀物质，冷冻干燥，即得IMF冻干原粉。
进一步地，所述紫外线吸收方法中使用的紫外线吸收剂为0.5％苯并三氮唑。
所述步骤(7)具体步骤如下：
a、模版IMF多肽MIP制备:
功能单体丙烯酰胺4mmol，模版IMF多肽0.6mmol，溶剂四氢呋喃7mmol，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯37mmol和引发剂偶氮二异丁腈20mg，置于玻璃试管中混和均匀，充氮气，抽出真空排除氧气后密封，60℃水浴恒温，聚合24h，得棒状体聚合物；将其粉碎，用75um筛分，用丙酮反复沉降，取下层粒度相近75um的颗粒，真空干燥，得IMF多肽MIP，备用；
b、高活性IMF多肽的提取:
称取混合均匀的IMF峰物质，与IMF多肽MIP以1:1重量比溶于5V、浓度25％甲醇，搅拌6h，加入20V丙酮，在5℃环境中存放过夜；次日离心收取沉淀物；沉淀物中加入5V、浓度5％冰醋洗脱吸附的IMF多肽，得纯化提取液。
试验过程：
将本发明实施例1IMF冻干原粉制成注射剂为例:
1、IMF生物抗衰因子注射剂注射小白鼠后对小白鼠寿命影响的试验：
在无菌条件下，称取IMF生物抗衰因子冻干原粉10克，用无热源水1000毫升，除菌、过滤、分装，得IMF生物抗衰因子注射剂。检测其微生物指标、热源物指标，其它全部安全检测指标符合(中国药典2010年版二部附录IB注射剂项下规定)。取3月龄美国NIH小白鼠200支，随机分实验组、对照组各100支，在相同喂养条件下，每25天分别尾静脉注射0.5毫升IMF生物抗衰因子注射剂和无菌生理盐水。饲养三年1095天。
实验结果:实验组平均存活率727天，对照组平均存活率549天。IMF生物抗衰因子注射剂能够显著提高美国NIH小白鼠寿命，其半数延寿百分比为32.4％。(P<0.01)。
半数存活时间(MST)：
对照组MST＝549(d)
实验组MST＝727(d)
半数延寿百分比＝(727-549)/549×100％＝32.4％(雌雄平均数)
2、IMF生物抗衰因子注射剂注射小白兔的抗衰协同试验：
取每只体重2.5公斤实验用小白兔10只，随机分实验组、对照组各5只，在相同喂养条件下，每25天分别耳静脉注射5毫升上述IMF生物抗衰因子注射剂，30、60、90天后分别取兔子耳静脉血，化验其SOD(超氧化物歧化酶)、LPO(过氧化脂质)，数据如表一所示。
表一 30、60、90天后兔子耳静脉血的SOD、LPO数值
(测试方法：红细胞SOD酶活性：丁克祥法。红细胞LPO含量：大石诚子法。)
试验结论：
一、IMF生物抗衰因子注射剂具有很好的抗衰协同作用。主要体现在IMF生物抗衰因子注射剂对提高机体的免疫、代谢等项指标。即能维持机体的免疫平衡，同时提高细胞代谢水平，从而发挥其抗病、抗衰作用。
二、机体SOD酶活性的升高与LPO的降低，是可相互验证的指标，它从机体代谢的不同侧面，同时验证了IMF生物抗衰因子注射剂有明显提高机体的代谢水平的能力(P<0.01)。
3、IMF生物抗衰因子注射剂对人胚肺二倍体成纤维细胞传代试验：
1.材料与方法
1.1 培养细胞(为人胚肺二倍体成纤维细胞2BS株，第10代，北京中科院生物制品研究所)；IMF生物抗衰因子注射剂；氢化可的松注射液(规格5mg/ml，北京第三制药厂)。
1.2 培养液：用Eagle’s TCM199作为基础配制培养液，加入10％小牛血清、1％谷氨酰胺、抗生素(青霉素K100μ/ml、硫酸庆大霉素50μ/ml、链霉素100μ/ml)，用5.6％NaHCO3，调pH7.2～7.4。
1.3 培养方法
1.3.1 IMF生物抗衰因子注射剂最佳浓度筛选：用侧面积为24cm的培养瓶将第10代人胚肺二倍体成纤维细胞2BS株分为10瓶(细胞起始浓度为6.63×104个/ml)，按照表二所示分为空白对照、阳性对照(氢化可的松注射液，用培养液稀释为5μg/ml)、试验组，在37℃、相对湿度85％的条件下培养。在此期间不换培养液，当pH值下降时，用5.6％NaHCO3调节使培养液的PH保持在7.2～7.4之间。
表二 IMF生物抗衰因子注射剂最佳有效浓度筛选(n＝8)
*培养第五天的细胞数量。存活时间(天)。使用浓度单位：ng/ml。
1.3.2 IMF生物抗衰因子注射剂对人胚肺二倍体成纤维细胞传代试验：将细胞分别接种到空白对照、阳性对照、试验组培养液中，使其细胞密度为5×104～10×104个/ml，然后均分为5瓶，置于37℃，相对湿度为85％的温湿培养箱中培养。用5.6％NaHCO3调节使培养液的PH保持在7.2～7.4之间。接种2～4天细胞成片，形成致密单层，即传代一次。然后弃去培养液，用0.2％胰酶消化5分钟后，用新培养液轻轻吹打，使细胞分散，计数，并稀释成5×104～10×104个细胞/ml，置于37℃，相对湿度为85％的温湿培养箱中培养。反复培养，直到细胞停止传代。
2.试验结果
2.1 由表二可知，IMF生物抗衰因子注射剂生命源注射剂对人胚肺二倍体成纤维细胞传代试验的最佳有效浓度为30×103ng/ml。
2.2 空白对照组：48代前，5组细胞成片时间为2～3天，细胞形态无明显区别。59代后开始出现衰老象征，细胞层变薄；64代时传代终止(培养15天仍未出现细胞单层)。
2.3 阳性对照组：55代前，5组细胞成片时间为2～3天，细胞形态无明显区别。65代后开始出现衰老象征，细胞层变薄；71代时传代终止。
2.4 IMF生物抗衰因子注射剂组：76代前，5组细胞成片时间为2～3天，细胞形态无明显区别。92代后开始出现衰老象征，细胞层变薄；98代时传代终止。
3.结论
试验结果：IMF生物抗衰因子注射剂使细胞传代终止时间由64代延长到98代，延长率为53.1％，统计结果P<0.01，具有非常显著差异，提示IMF生命源注射液对人类具有显著的延长寿命的功效。
4、IMF生物抗衰因子注射剂进行人体静脉注射试验：
近几年来，对100例自愿接受IMF生物抗衰因子注射剂进行人体静脉注射实验(50ml×5次)，用药前，有严惩衰老体征；体弱多病，面黄肌瘦，长期咳嗽，患有慢性支气管炎，食欲、睡眠差，神经衰弱，怕过冬季。使用IMF生物抗衰因子注射剂源静脉注射剂(50ml×5次)后，一个月检测，食欲、睡眠、视力、听力明显改善，精神变好，皮肤有光泽、弹性增强、咳嗽、哮喘遇冷也未复发，在短时间内恢复了健康体质。平均血液SOD酶活性用药前为1850u/gHb，用药后为3610u/gHb，增高率为95.0％(P<0.01)。其它异常生化指标均能转为正常。一年后随访，上述抗衰老表现稳定，抗衰作用持久。与上述动物、细胞学实验研究结果一致。
5、应用MIT技术(分子烙印技术)进一步纯化IMF多肽活性的试验：
对照组：未采用分子烙印技术纯化的IMF冻干原粉的制备方法获得的IMF冻干原粉(简称Y-IMF)；
试验组：采用分子烙印技术的本发明生物抗衰老IMF冻干原粉的制备方法获得的IMF冻干原粉(简称F-IMF)；
应用人胚肺二倍体成纤维细胞2BS株细胞传代试验评价IMF多肽活性的试验：
5.1材料与方法
5.1.1 培养细胞(为人胚肺二倍体成纤维细胞2BS株，第10代，北京中科院生物制品研究所)；IMF生物抗衰因子注射剂；氢化可的松注射液(规格5mg/ml，北京第三制药厂)。
5.1.2 培养液：用Eagle’s TCM199作为基础配制培养液，加入10％小牛血清、1％谷氨酰胺、抗生素(青霉素K100μ/ml、硫酸庆大霉素50μ/ml、链霉素100μ/ml)，用5.6％NaHCO3，调pH7.2～7.4。
5.1.3 培养方法
5.1.3.1 比较两种IMF生物抗衰因子生物活性方法：用侧面积为24cm的培养瓶将第10代人胚肺二倍体成纤维细胞2BS株分为10瓶(细胞起始浓度为6.63×104个/ml)，按照表三所示分为Y-IMF检测用量5μg/ml、F-IMF检测用量5μg/ml，在37℃、相对湿度85％的条件下培养。在此期间不换培养液，当pH 值下降时，用5.6％NaHCO3调节使培养液的PH保持在7.2～7.4之间。
表三 比较两种IMF生物抗衰因子生物活性检测
5.2.试验结果
5.2.1 由表三可知，相同使用浓度下F-IMF对细胞的生长、发育、形态、传代等生理指标明显高于Y-IMF。经过MIT技术制备的IMF多肽由于其生物活性、纯度等指标的大大提高，用来生产的IMF多肽注射剂产品，其安全性，有效性也相应的提高。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。