本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种毛囊干细胞的无血清培养基及其制备方法。
背景技术：
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。头发毛囊中含有大量干细胞，是最容易获得的干细胞来源之一。毛囊干细胞是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。体外培养研究中的毛囊干细胞表现出高克隆形成能力，具有很高的再生潜能。由于毛囊干细胞来源于毛发，可以直接从人体自身取得，数量极其丰富，且没有任何并发症，对人完全无创，现已成为皮肤组织工程学研究的焦点。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种毛囊干细胞的无血清培养基及其制备方法，采用该无血清培养基体外培养时，毛囊干细胞大量快速增长，且生长稳定，纯度高，且该无血清培养基的制备方法简单，保留了培养基中各组分的有效活性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种毛囊干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM 基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物5-10％ (v/v)
胎球蛋白 0.1-5mg/ml
维生素C 35-80ng/ml
L-谷氨酰胺1.5-5mmol/ml
表皮生长因子1-20ng/ml
葡萄糖 5-15μM
2-巯基乙醇25-120μM
青链霉素双抗溶液2-15μM。
胎球蛋白，发现于胎牛血清，两条肽链自同一前体切割产生并以一对二硫键相连，含量占总蛋白质的45%，等电点较低，含糖量达35%，有3条寡糖链，由分子质量不等的糖蛋白组成，具有细胞所需的生长因子，促进细胞胞吞等功能。
维生素C是大部分生物的必需营养，是一种抗氧化剂，保护细胞组织免于自由基的威胁。
L-谷氨酰胺在细胞培养时起到很重要的作用。脱掉氨基后，L- 谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢；在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。
表皮生长因子是一种小肽，由53 个氨基酸残基组成，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。
葡萄糖是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。
2- 巯基乙醇是一种有机化合物，其化学式为HOCH2CH2SH，它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能团，通常用于二硫键的还原，保护二硫键，从而使蛋白质不被氧化掉而失活。
青链霉素双抗溶液用于抑制细菌增长，为干细胞提供无菌的生长环境。
本发明的毛囊干细胞的无血清培养基的有益效果在于：青链霉素双抗溶液抑制了培养基内的细菌增长，为毛囊干细胞提供无菌的生长环境；维生素C和2-巯基乙醇构建了一个良好的毛囊干细胞分裂环境，防止毛囊干细胞在生长的过程中干细胞的组分被氧化而失掉活性；表皮生长因子促进了的毛囊干细胞分裂生长，胎球蛋白、维生素C、L-谷氨酰胺及葡萄糖为毛囊干细胞的生长提供足够的能量，使新生的细胞具有活性；采用本发明的无血清培养基体外培养毛囊干细胞，毛囊干细胞可快速增长，且生长稳定，纯度高。
优选的，添加成份及其含量如下：
血清替代物6-10％ (v/v)
胎球蛋白 0.5-5mg/ml
维生素C 40-80ng/ml
L-谷氨酰胺1.5-5mmol/ml
表皮生长因子5-20ng/ml
葡萄糖 8-15μM
2-巯基乙醇50-120μM
青链霉素双抗溶液5-15μM。
优选的，添加成份及其含量如下：
血清替代物6％ (v/v)
胎球蛋白 0.5mg/ml
维生素C 40ng/ml
L-谷氨酰胺2mmol/ml
表皮生长因子5ng/ml
葡萄糖 8μM
2-巯基乙醇50μM
青链霉素双抗溶液5μM。
优选的，添加成份及其含量如下：
血清替代物8％ (v/v)
胎球蛋白 3mg/ml
维生素C 70ng/ml
L-谷氨酰胺4mmol/ml
表皮生长因子15ng/ml
葡萄糖 12μM
2-巯基乙醇100μM
青链霉素双抗溶液10μM。
一种毛囊干细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：在无菌超净工作台中，取适量低糖DMEM 基础培养基，按上述成份含量加入血清替代物、胎球蛋白、维生素C、L-谷氨酰胺、表皮生长因子、葡萄糖、2-巯基乙醇及青链霉素双抗溶液，吹打混匀，过滤除菌即获得毛囊干细胞的无血清培养基。
优选的，过滤除菌为采用0.1～0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌，采取正压过滤，正压过滤较之负压过滤具有流速高、过滤快、不易污染的特点，避免胎球蛋白产生大量气泡及避免L-谷氨酰胺失去有效性。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
本实施例的一种毛囊干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM 基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物5％ (v/v)
胎球蛋白 0.1mg/ml
维生素C 35ng/ml
L-谷氨酰胺1.5mmol/ml
表皮生长因子1ng/ml
葡萄糖 5μM
2-巯基乙醇25μM
青链霉素双抗溶液2μM。
实施例2
本实施例的一种毛囊干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM 基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物6％ (v/v)
胎球蛋白 0.5mg/ml
维生素C 40ng/ml
L-谷氨酰胺2mmol/ml
表皮生长因子5ng/ml
葡萄糖 8μM
2-巯基乙醇50μM
青链霉素双抗溶液5μM。
实施例3
本实施例的一种毛囊干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM 基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物7％ (v/v)
胎球蛋白1mg/ml
维生素C50ng/ml
L-谷氨酰胺3mmol/ml
表皮生长因子10ng/ml
葡萄糖10μM
2-巯基乙醇80μM
青链霉素双抗溶液8μM。
实施例4
本实施例的一种毛囊干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM 基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物8％ (v/v)
胎球蛋白 3mg/ml
维生素C 70ng/ml
L-谷氨酰胺4mmol/ml
表皮生长因子15ng/ml
葡萄糖 12μM
2-巯基乙醇100μM
青链霉素双抗溶液10μM。
实施例5
本实施例的一种毛囊干细胞的无血清培养基，由低糖DMEM 基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物10％ (v/v)
胎球蛋白 5mg/ml
维生素C 80ng/ml
L-谷氨酰胺5mmol/ml
表皮生长因子20ng/ml
葡萄糖15μM
2-巯基乙醇120μM
青链霉素双抗溶液15μM。
制备方法
实施例1至5的毛囊干细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：在无菌超净工作台中，取适量低糖DMEM 基础培养基，分别按实施例1至5所述的成份含量加入血清替代物、胎球蛋白、维生素C、L-谷氨酰胺、表皮生长因子、葡萄糖、2-巯基乙醇及青链霉素双抗溶液，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌即获得毛囊干细胞的无血清培养基。
对照试验
取适量人体毛发，在室温下，用消化液消化，待成纤维细胞脱落后，洗掉成纤维细胞，获得毛囊干细胞群，将毛囊干细胞群置于37°培养瓶，加入实施例1至5的一种毛囊干细胞的无血清培养基，以后每24小时更换培养液一次，使毛囊干细胞群获得足够养分充分生长，传代五代，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化获得培养后的毛囊干细胞。
以普通一种毛囊干细胞的无血清培养基采用上述培养方法培养毛囊干细胞，并与采用实施例1至5毛囊干细胞培养基培养的毛囊干细胞进行对照，结果如表1。
表1普通毛囊干细胞无血清培养基与实施例1至5毛囊干细胞培养基培养的毛囊干细胞进行对照
细胞形态鉴定
用溴化丙锭染细胞核，方法如下：细胞贴壁1小时后，用质量百分比为4％的多聚甲醛固定15分钟；然后用磷酸缓冲液洗两遍；10微克/毫升的溴化丙锭在室温22℃左右染核15分钟；用磷酸缓冲液洗三遍。结果发现，毛囊干细胞核质比很大，则细胞核在细胞中所占的比例很大，生长良好。
由上述对照试验及细胞形态鉴定可知，实施例1至5毛囊干细胞的无血清培养基得到的毛囊干细胞比普通无血清培养基得到的毛囊干细胞生长速度快，增殖能力强，且纯度高，采用本发明的毛囊干细胞的无血清培养基制备方法获得的培养基保留了各成份的活性，使培养基的作用发挥到最佳。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。