一种适用于土曲霉的表达载体及其制备方法与流程

文档序号:12697376阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种适用于土曲霉的表达载体,其特征在于,所述表达载体由在pUC19的多克隆位点处插入土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的启动子和终止子而获得,其中启动子序列为SEQ ID NO.1中的第2241-2990位,终止子序列为SEQ ID NO.1中的第3721-4230位。

2.如权利要求1所述的表达载体,其特征在于,所述启动子和终止子之前插入有一段红色荧光蛋白基因,所述红色荧光蛋白基因的序列为SEQ ID NO.1中的第3034-3715位。

3.如权利要求2所述的表达载体,其特征在于,所述红色荧光蛋白基因产生的红色荧光由波长为500~560nm的绿光激发而得。

4.如权利要求2所述的表达载体,其特征在于,所述载体在所述启动子序列与所述红色荧光蛋白序列之间存在Sal I、Nru I两个酶切位点。

5.如权利要求1所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体在所述启动子的序列的上游及所述终止子的序列的下游存在通用引物M13的结合位点。

6.如权利要求1至5任意一项所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

7.一种如权利要求1至6任意一项所述的表达载体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

以土曲霉基因组为模板,Ppdc-F、Ppdc-R为引物进行PCR扩增,得到土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的pdc启动子序列;

将所述土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的pdc启动子序列转化至JM109中,扩大培养,并提取质粒;

将提取的质粒与pUC19先后通过HindIII和Sse8387I分步酶切,得到有可互补的粘性末端的pdc启动子序列和pUC19;

将所述有可互补的粘性末端的pdc启动子序列和pUC19进行重组,得到含有启动子序列的重组载体;

按照上述步骤,依次将启动子序列、终止子序列、红色荧光蛋白基因导入所述重组载体中,获得所述表达载体。

8.如权利要求7所述的表达载体的制备方法,其特征在于,所述终止子序列导入所述重组载体的过程为:

以土曲霉基因组为模板,Tpdc-F、Tpdc-R为引物进行PCR扩增,得到土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的pdc终止子序列;

将土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的pdc终止子序列转化至JM109中,扩大培养,并提取质粒。

将提取的质粒与已插入了启动子的pUC19先后通过KpnI和EcoRI分步酶切,得到有可互补的粘性末端的pdc终止子序列和酶切载体pUC19;

将上一步得到的所述有可互补的粘性末端的pdc终止子和酶切载体pUC19进行重组,得到同时含有所述启动子和终止子序列的重组载体。

9.如权利要求8所述的表达载体的制备方法,其特征在于,所述红色荧光蛋白基因导入所述重组载体的过程为:

以红色荧光蛋白为模板,DsRed-F、DsRed-R为引物进行PCR扩增,得到所述红色荧光蛋白基因序列;

将所述红色荧光蛋白基因序列转化至JM109中,扩大培养,并提取质粒;

将提取的质粒与已插入启动子、终止子序列的pUC19先后通过SalI和Sse8387I分步酶切,得到有可互补的粘性末端的红色荧光蛋白基因序列和酶切载体pUC19;

将上一步得到的红色荧光蛋白基因序列、酶切载体pUC19进行重组,得到所述表达载体。

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