一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段及其应用的制作方法

本发明涉及一种dna片段，特别涉及一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的dna片段及其应用。

背景技术：

通过基因重组技术生产有价值的外源蛋白质是当今生物技术研究与开发的热点之一。细菌具有生长快、易培养、表达量高以及分子操作简单的特点，这使得它们已广泛地开发应用于异源蛋白质的表达。其中，枯草芽抱杆菌由于其安全无毒、遗传背景清晰、分泌表达水平高等诸多优点，而成为工业用理想的宿主细胞。

枯草芽抱杆菌中表达异源蛋白需要各种元件，其中启动子对于表达水平的影响至关重要。通常有两种思路进行启动子的遗传改造：一种方式是对目的基因本身的启动子进行突变改造，从而提高启动子的活性；另一种方式是将原有的启动子替换成其他的天然或人工构建的启动子，从而彻底改变下游基因的表达谱，实现对基因转录水平的人为控制。目前成功用于枯草芽抱杆菌表达系统的启动子主要有p43、pamyq、pspac、pxyla等，这些启动子在实验室的富集培养基中表现良好，但鲜见它们被用于酶蛋白的工业放大生产。因此，有必要找到更高效的、适合于工业培养基生产表达的启动子，以适应发酵对表达水平越来越高的要求。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的dna片段。

本发明的另一目的在于提供所述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的dna片段的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的dna片段，所述dna片段为如下任一序列：

(a)如seqidno.1所示的核苷酸序列或者其互补序列；

(b)对如seqidno.1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与seqidno.1所示的核苷酸序列相同的作为启动子功能的核苷酸序列或者其互补序列；

(c)对如seqidno.1所示的核苷酸序列添加一个或多个核糖体结合位点的序列。

所述的核糖体结合位点的序列为如seqidno.2所示的核苷酸序列。

所述的枯草芽孢杆菌具有启动子功能的dna片段在蛋白表达中的应用。

一种载体，包含如seqidno.1所示的核苷酸序列和如seqidno.2所示的核糖体结合位点的序列。

所述的载体优选为质粒载体，含有如seqidno.7所示的核苷酸序列。

一种表达质粒，包含上述载体以及与该载体可操作连接的位于所述具有启动子功能的dna片段下游编码异源蛋白质核苷酸序列。

所述的异源蛋白质核苷酸序列为好热地芽孢杆菌(geobacilluskaustophilus)编码的耐热β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，或为茂原链霉菌(streptomycesmobaraensia)编码的转谷氨酰胺酶的核苷酸序列。

一种重组工程细胞，为上述载体或者上述质粒转化或转导宿主细胞得到的细胞株。

所述的宿主细胞为芽孢杆菌。

所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明涉及运用rna-seq技术测定枯草芽孢杆菌在对数生长后期的全基因转录组，筛选高表达的基因，在枯草芽孢杆菌中找到一个转录活性高的基因。克隆所筛选的高表达基因对应的启动子序列，并应用于耐热β-半乳糖苷酶基因(bgab)的表达，通过测定bgab的活性，证明筛选的启动子在枯草芽孢杆菌中具有高活性。应用于转谷氨酰胺酶(mtg)的表达，通过sds-page电泳图验证其蛋白表达。

2、本发明提供了一种dna片段，该dna是一启动子，具有很强的特异表达活性，在不需要添加诱导物的条件下即能实现外源基因的高表达，将其运用于耐热β-半乳糖苷酶和转谷氨酰胺酶的表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的工具。

附图说明

图1是实施例2中生长对数后期的枯草芽孢杆菌提取总rna电泳图；其中，泳道1和2分别为生长对数后期的枯草芽孢杆菌提取总rna。

图2是实施例3中扩增pydza的pcr产物电泳图；其中，泳道m为dnamarker，泳道1和2为pydza的pcr扩增产物。

图3是实施例4表达质粒pbe-pydza-samyq-bgab的构建示意图。

图4是实施例5中扩增pydza+samyq片段电泳图；其中，泳道m为dnamarker，泳道1和2为pydza+samyq扩增产物。

图5是实施例5表达质粒pbe-pydza-samyq-promtg的构建示意图。

图6是实施例6b.subtilisatcc6051(pbe-pydza-samyq-promtg)转化子mtg表达的sds-page电泳胶图；其中，泳道m为蛋白marker，泳道1为枯草芽孢杆菌b.subtilisatcc6051胞外分泌蛋白，泳道2为b.subtilisatcc6051(pbe-pydza-samyq-promtg)胞外分泌蛋白，箭头表示目的蛋白mtg的位置。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括pcr扩增、质粒提取、dna片段酶切、连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》(第三版)(sambrookj,russelldw,janssenk,argentinej.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。

从一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168，购于广东省微生物菌种保藏中心)培养的生产对数后期阶段提取细菌rna。对细菌rna进行转录组测序建库，去掉核糖体rna，对mrna进行反转录建立cdna文库。对细菌全转录组进行分析,根据代表基因转录水平的rpkm值判断其表达量水平较高的基因，然后分析其启动子区。将所选的启动子接入载体，测定启动子在枯草芽孢杆菌中的活性。

实施例1

细菌的培养：将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168)从-80℃甘油管取出划线于lb固体平板上37℃培养16～24h，挑取单菌落于10ml的1％终浓度玉米淀粉的lb液体培养基，37℃，200rpm培养至od60020～25(分光光度计,日本hitachi公司)。

实施例2

细菌总rna的提取、转录组文库的建立及rna-seq测序：收集实施例1得到的细胞培养液1ml于8000g快速离心1min，用于提取细菌总rna(见图1)。具体的提取方法参考omegabio-tek公司的细菌总rna提取试剂盒。用于rna-seq测序文库制备的样品经agilenttechnologies2100bioanalyzer检测合格，经过dnasei(rnasefree)处理混入的dna分子，用ribo-zero(gram-positivebacteria)kit(usa)去掉占总rna绝大多数的rrna，纯化得到的mrna。将mrna先打断为合适大小的片段，以片段化的mrna为模板，加入反转录酶和随机引物，合成双链cdna，然后用试剂盒qiaquickpcrpurificationkit(qiagen)纯化合成的cdna。补平cdna的粘性末端，然后在一条链上加上一个腺嘌呤核苷酸，以这个突出的a配对含有突出的t的一级接头序列。在分别能配对一级接头两端的引物存在的条件下进行pcr扩增，经过多次循环，将pcr结果进行凝胶电泳并切胶回收预定大小的胶带，这时得到的加上二级接头的序列组成的文库进行上机测序(按专利文献：潘力等.一种具有启动子功能的dna片段与应用.cn201510074949.0[p].2015.方法)。rna-seq文库的测序由广州基迪奥生物科技有限公司提供测序服务。测序时分别将两端向中心的100bp的序列信息读出(pe100)，称为reads，将这些reads比对到细菌基因组上就可以进行注释及表达量计算等后续生物信息学分析。

实施例3

筛选并克隆启动子片段：通过rna-seq测序数据分析枯草芽孢杆菌转录本结构及全基因组分析含有转录起始位置的基因，通过rpkm量化，筛选一株表达量高的基因，其核苷酸序列如下所示：

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以菌株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168)的基因组dna为模板，引物f-pydza(5’-cggaattccgttctgttacagatggagg-3’)和r-pydza(5’-ggactagtaaatcgccctccttgtggac-3’)进行扩增300bp大小的dna片段，即pydza启动子片段(见图2)，与目的产物大小相符。引入酶切位点ecori，spei。

实施例4

构建bgab表达质粒：以质粒pbe-rbs-samyq-bgab(按专利文献：潘力等.一种具有启动子功能的dna片段及其应用.cn201610430767.7[p].2016.构建)为表达质粒，用限制性内切酶ecori和spei在酶切位点切开成线性质粒，将实施例3中得到带ecori，spei酶切位点的pydza启动子片段经过酶切、纯化后插入该线性质粒构建得到目的启动子的bgab基因胞外表达质粒pbe-pydza-samyq-bgab(见图3)。

实施例5

构建mtg表达质粒：以质粒pbep43-promtg(按专利文献：潘力等.一株重组的枯草芽孢杆菌及其生产转谷氨酰胺酶的方法.cn201210052578.2[p].2012.构建)为表达质粒，用限制性内切酶ecorⅰ和bamhⅰ的酶切位点。以pbe-pydza-samyq-bgab质粒为模板，引物f-pydza(5’-cggaattccgttctgttacagatggagg-3’)、r-samyq(5’-aaggatccggctgatgtttttgtaatcg-3’)扩增5’端带有ecorⅰ酶切位点，3’端带有bamhⅰ酶切位点的约450bppydza-samyq片段(见图4)。用限制性内切酶ecorⅰ和bamhⅰ消化pydza-samyq片段，回收，纯化后插入用相同内切酶酶切位置的质粒pbep43-promtg，构建得到mtg表达胞外质粒pbe-pydza-samyq-promtg(见图5)。其中：pydza-samyq核苷酸序列为：

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实施例6

启动子表达水平的检测：将构建好的目的启动子的bgab表达质粒pbe-pydza-samyq-bgab和mtg表达质粒pbe-pydza-samyq-promtg以及质粒pbep43-promtg(按专利文献：潘力等.一株重组的枯草芽孢杆菌及其生产转谷氨酰胺酶的方法.cn201210052578.2[p].2012.构建)先用化学转化法转化至大肠杆菌(e.colijm110)，得到阳性克隆子，经测序后提取质粒，用电转化的方法转化至枯草芽孢杆菌b.subtilisatcc6051，具体方法参考非专利文献记录nataliap，zakataeva，oksanavetal.asimplemethodtointroducemarker-freegeneticmodificationintochromosomeofnaturallynontransformablebacillusamyloliquefaciensstrains[j].applmicrobiolbiotechnol.2010,85:1201-1209)，得转化菌株b.subtilisatcc6051(pbe-pydza-samyq-bgab)、b.subtilisatcc6051(pbe-pydza-samyq-promtg)和b.subtilisatcc6051(pbep43-promtg)。

将得到的转化子b.subtilisatcc6051(pbe-pydza-samyq-bgab)、b.subtilisatcc6051(pbe-pydza-samyq-promtg)和b.subtilisatcc6051(pbep43-promtg)培养于10mllb培养基中(卡那霉素20μg/ml)，37℃，200rpm活化12h，将活化的种子液接种于50mllb培养基中(卡那霉素20μg/ml，1％(w/w)玉米淀粉)，接种量为1％(体积比)，37℃，200rpm总发酵48h，每隔12小时取样。

β-葡萄糖半乳糖苷酶酶活的测定：将32μl发酵上清液与288μl0.25％onpg(o-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside，邻硝基苯β-d-半乳吡喃糖苷)混合，55℃下温育15min，反应终止加入320μl的10％(w/w)na2co3。反应呈显色反应，在405nm波长下测定吸光值。对照菌株b.subtilisatcc6051(pbe-rbs-samyq-bgab)无显色反应，在405nm波长下测定吸光值与空白对照(lb)差不多，无β-葡萄糖半乳糖苷酶活性。结果表明启动子pydza启动β-葡萄糖半乳糖苷酶表达，36h达到最高酶活44.3u/ml。

sds-page：将36h发酵液离心取上清，上清液跑sds-page电泳，与野生型枯草芽孢杆菌b.subtilisatcc6051作为对照，蛋白胶图显示在44-46kda有条带和mtg蛋白大小一致，而野生型对照在此大小范围内无条带，实验结果说明mtg蛋白酶原得到表达(见图6)。

mtg酶活的测定：取0.2ml发酵上清液，加入50μl0.1％的胰蛋白酶，混匀后37℃水浴10min，即得到成熟的转谷氨酰胺酶。酶活测定采用crossowicz比色法，以n-α-cbz-gln-gly作为底物，将150μl的底物与50μl激活后的成熟酶混匀后37℃反应10min，然后迅速加入200μl的反应终止剂盐酸-氯化铁-三氯乙酸(3moll/的盐酸、12％(v/v)三氯乙酸和5％(w/v)氯化铁按1:1:1的比例混合。)，同时以l-谷氨酸-γ-单羟肟酸制作标准曲线，用酶标仪测量反应液在525nm下的吸光值。酶活力单位定义为：37℃时1min催化n-α-cbz-gln-gly生成1μmoll-谷氨酸-γ-单羟肟酸所需要的酶量。野生菌株b.subtilisatcc6051无显色反应，吸光值与空白对照(lb)差不多，没有转谷氨酰胺酶活性。结果表明启动子pydza表达mtg，36h达到最高酶活82.68u/ml，相比传统强启动子p43表达mtg在36h的酶活61.59u/ml高了1.3倍。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>华南理工大学

<120>一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的dna片段及其应用

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<213>枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）

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<223>dna片段+核糖体结合序列

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