一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法与流程

本发明涉及免疫学技术领域，具体涉及一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法。

背景技术：

胰高血糖素(升糖素)是一种由胰脏胰岛α-细胞分泌的激素，是由29个氨基酸组成直链多肽，分子量为3485道尔顿。胰高血糖素是一种促进分解代谢的激素，它具有很强的促进糖原分解和糖异生作用，使血糖明显升高，1mol/l的激素可使3×10⁶mol/l的葡萄糖迅速从糖原分解出来。胰高血糖素还可激活脂肪酶，促进脂肪分解，同时又能加强脂肪酸氧化，使酮体生成增多。

胰高血糖素分泌过多会使血糖浓度增大，所以2型糖尿病的发生与发展中不仅是胰岛素功能和分泌异常所致，胰高血糖素也在发挥重要作用，而且也可能是糖尿病发病的一个独立因素。胰高血糖素异常升高是导致2型糖尿病患者血糖偏高的重要因素，检测胰高血糖素水平有助于临床准确判断糖尿病患者病情。目前已知检测胰高血糖素的方法主要是放射性免疫法(ria)，也有报道采用胰高血糖素单抗依据免疫学原理进行检测的方法，如专利cn105116140a。

卵黄抗体是近年来受到广大关注的一个方向，通过免疫母鸡得到免疫后的鸡蛋，从鸡蛋中提取抗体。单抗的制备具有不确定性，细胞的融合与亚克隆的过程中都有可能出现不可预料的现象，如果出现这些现象都要进行重新去做。而卵黄抗体很少会出现这种不可控现象，相比单抗其操作简单，稳定性好，得到的产率较高。卵黄抗体是一种生产工艺较为简单的廉价抗体，具有较强的耐酸耐碱耐热能力。一般的卵黄抗体的制备方法与多克隆抗体的制备方法相同，区别在于卵黄抗体避免提取动物血清，只需从鸡蛋中获取。然而这种一般的制备方法用来制备胰高血糖素抗体，其抗体量较少。目前，尚没有关于制备胰高血糖素卵黄抗体的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法，使得所述制备方法能够提高卵黄抗体量，并且具备较高的效价。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法，包括：

步骤1、利用碳二亚胺法将胰高血糖素与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫抗原；

步骤2、将免疫抗原免疫产蛋鸡，取鸡蛋蛋黄提取抗体，获得卵黄抗体粗提物；

步骤3、将卵黄抗体粗提物进行纯化，获得胰高血糖素卵黄抗体纯品。

针对现有工艺中缺少胰高血糖素卵黄抗体的制备方法的问题，本发明通过胰高血糖素与牛血清蛋白偶联形成免疫抗原，同时优化免疫抗原免疫、提取抗体、抗体纯化等工艺步骤，获得效价较高、抗体量较多的胰高血糖素卵黄抗体。

作为优选，步骤1为：

称取胰高血糖素和n-羟基琥珀酰亚胺完全溶于dmf中，再加入dcc反应，反应液离心后收取上清液，将上清液滴加到溶有bsa的缓冲液中进行反应，然后将所得反应液透析，得到免疫抗原。

在本发明具体实施过程中，步骤1为：

称取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmoln-羟基琥珀酰亚胺完全溶于1ml的dmf中，再加入0.12mmol的dcc，置于4℃下反应搅拌12小时或搅拌过夜；反应后将反应液10000r/min离心10min，离心后收取上清液，将上清液缓慢滴加到溶有2mmolbsa的pbs中，4℃下反应搅拌12小时或搅拌过夜；反应后将反应液放入透析袋中，在4℃条件下用磷酸缓冲盐溶液透析三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原。

作为优选，步骤2为：

步骤2.1、将免疫抗原免疫产蛋鸡；

步骤2.2、取免疫鸡蛋蛋黄采用peg6000三步提纯法进行粗提纯，获得卵黄抗体粗提物。

在本发明具体实施过程中，步骤2为：

步骤2.1、将免疫抗原免疫产蛋鸡；

步骤2.2、将所得的免疫鸡蛋消毒清洗，鸡蛋破壳，收集蛋黄并除去残留卵白蛋白，破卵黄膜收集卵黄液，加入3倍卵黄液体积的含有3.5％peg6000的pbs，搅拌均匀后4℃下过夜；第二天离心取上清液，过滤，在滤液中加入固体peg6000至最终浓度为12％，搅拌均匀，在4℃下离心弃去上清液，收集沉淀部分，获得卵黄抗体粗提物。

其中，步骤2.1可具体如下：

首次免疫采用弗氏完全佐剂与免疫抗原1:1乳化，在产蛋鸡的双翅、胸肌位置采用多点注射；其余四次免疫采用弗氏不完全佐剂与免疫抗原1:1乳化，共免疫五次；每次间隔15天，免疫剂量为0.5ml/只；从第二次免疫后开始收集免疫鸡蛋。

作为优选，步骤3为：

将卵黄抗体粗提物用饱和硫酸铵法纯化，最后进行透析，获得胰高血糖素卵黄抗体纯品。

在本发明具体实施过程中，步骤3为：

将卵黄抗体粗提物用pbs溶解，搅拌下加入固体硫酸铵至最终浓度为50％饱和度，4℃静置过夜；离心后，弃去上清液，收集沉淀部分以少量pbs溶解，边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为33％，4℃静置2h，10℃离心，收集沉淀，将沉淀溶用pbs中进行透析，每隔12h换一次透析液，透析三天，收集透析袋中液体，真空冷冻干燥，获得胰高血糖素卵黄抗体纯品。

采用常规的卵黄抗体制备方法与本发明所述方法进行对比，结果显示，本发明所述制备方法能够获得较多的胰高血糖素卵黄抗体，并具备较高的效价。同时，和其他蛋白偶联形成的免疫抗原相比，本发明胰高血糖素和牛血清蛋白偶联形成免疫抗原更适合制备高效价、高抗体量的卵黄抗体。

由以上技术方案可知，本发明通过胰高血糖素与牛血清蛋白偶联形成免疫抗原，同时优化免疫抗原免疫、提取抗体、抗体纯化等工艺步骤，获得效价较高、抗体量较多的胰高血糖素卵黄抗体。

附图说明

图1所示为本发明所述的免疫抗原与bsa电泳检测图；其中，1为免疫抗原，2为bsa；

图2所示为本发明制备的胰高血糖素卵黄抗体粗提物和纯品的电泳图；其中，1为粗提物，2为纯品；

图3所示为本发明制备的胰高血糖素卵黄抗体效价图。

具体实施方式

本发明公开了一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述制备方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种胰高血糖素卵黄抗体的制备方法做进一步说明。

实施例1：本发明制备胰高血糖素卵黄抗体的方法

1、免疫抗原合成

称取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmoln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)完全溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，再加入0.12mmol的二环己基碳二亚胺(dcc),置于4℃下反应搅拌过夜(或12小时)。第二天把反应液10000r/min,10min离心,离心后收取上清液，将上清液缓慢滴加到溶有bsa(2mmol)的pbs(8ml,10mmol,ph7.4)中，4℃下反应搅拌过夜(或12小时)。将所得反应液放入透析袋中，在4℃条件下用磷酸缓冲盐溶液透析(pbs，0.01mol/lph7.4)三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原。

免疫抗原电泳检测(图1)，结果显示，免疫抗原的电泳图与bsa相比发生了明显变化，说明半抗原与载体蛋白偶联成功。

2、卵黄抗体粗提

免疫抗原免疫产蛋母鸡(白羽鸡)，首次免疫采用弗氏完全佐剂与免疫抗原1:1乳化，在产蛋鸡的双翅、胸肌位置采用多点注射；其余四次免疫采用弗氏不完全佐剂与免疫抗原1:1乳化，共免疫五次；每次间隔15天，免疫剂量为0.5ml/只；从第二次免疫后开始收集免疫鸡蛋，取未免疫的鸡蛋作为阴性对照，将每日收集的免疫鸡蛋进行编号，于4℃保存。

将所得的鸡蛋用75％酒精消毒清洗，鸡蛋破壳，收集蛋黄并在无菌定性滤纸上滚动以除去残留卵白蛋白，破卵黄膜收集卵黄液，测卵黄液体积，加入含有3.5％(即3.5gpeg/100mlpbs)的peg-pbs，体积为蛋黄体积的3倍，在室温下用磁力搅拌器充分搅拌30min后，4℃下过夜。第二天10000r/min离心30min，取上清液，4层纱布过滤，测定滤出液的体积；在滤液中加入固体peg6000至最终浓度为12％(即100ml加入12gpeg6000)，室温下磁力损拌器充分搅拌溶化后再搅拌30min，在4℃下以10000r/min离心弃去上清液，收集沉淀部分，即卵黄抗体粗提物(电泳检测结果见图2)。

3、卵黄抗体纯化

将卵黄抗体粗提物用20-50mlpbs溶解；在磁力搅拌器搅拌下加入固体硫酸铵至最终浓度为50％饱和度，4℃静置过夜；离心后，弃去上清液，收集沉淀部分以少量pbs溶解；边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为33％，4℃静置2h，10℃8000r/min离心20min，收集沉淀，将沉淀溶于5-10ml的0.01mol/l的pbs中进行透析，每隔12h换一次透析液，透析三天，收集透析袋中液体，真空冷冻干燥，将干燥成品研磨成粉末即为胰高血糖素卵黄抗体纯品，于-20℃保存。经检测，本发明方法每个卵黄可获得100mg以上的igy(卵黄抗体，电泳检测结果见图2)。

实施例2：本发明胰高血糖素卵黄抗体的效价检测

采用间接elisa法检测卵黄抗体的效价

1、包被抗原的制备

称取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmoln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)完全溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，再加入0.12mmol的二环己基碳二亚胺(dcc),置于4℃下反应搅拌过夜(或12小时)。第二天把反应液10000r/min,10min离心,离心后收取上清液，将上清液缓慢滴加到溶有ova(2mmol)的pbs(8ml,10mmol,ph7.4)中，4℃下反应搅拌过夜(或12小时)。将所得反应液放入透析袋中，在4℃条件下用磷酸缓冲盐溶液透析(0.01mol/lph7.4)三天，每天换三次透析液，得到包被抗原；

2、包被：将包被抗原用碳酸盐缓冲液(cbs)稀释至最佳包被浓度4ug/ml并充分混匀，使用移液枪以100μl/孔添加到微孔板中，置于37℃水浴锅温浴1小时后，再放置于4℃冰箱中包被过夜；

3、清洗：将孔中的液体甩干，用pbst洗涤液清洗3次，再将孔中剩余的液体在吸水纸上拍干；

5、封闭：用含浓度为30mg/ml的脱脂奶粉磷酸缓冲盐溶液，270μl/孔加入到微孔板中，37℃温浴1小时，重复步骤3；

6、竞争反应：将实施例1最后所得的胰高血糖素卵黄抗体用磷酸缓冲盐溶液，按体积倍比稀释成1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000的溶液，以100μl/孔加入到微孔板中，同时增加空白对照，37℃温浴1小时，重复步骤3；

7、加酶标二抗：加入用磷酸缓冲盐溶液稀释5000倍数的酶标二抗，按照100μl/孔添加到微孔板中，放置于37℃温浴1小时，重复步骤3；

8、显色：在已配制的10ml底物缓冲液中，加入10μl30％过氧化氢并充分混匀(现配现用)，按照100μl/孔加到微孔板中，置于37℃下避光温育15分钟。

9、终止和读数：向酶标版的微孔中加入50μl/孔的2m硫酸终止反应。设定酶标仪测定波长参数为450nm，并测定其光密度(od)值。阳性的判定原则：样品孔od值大于空白处读数的2.1倍即可判定为阳性。

10、结果见图3，由图3可以看出，随着免疫天数的增加，抗体的效价也在不断增加，当免疫天数为56-84天的时候抗体效价最高为1:16000。

实施例3：不同多抗体制备方法的对比

方法1：实施例1方法；

方法2：以klh偶联胰高血糖素作为免疫抗原按照实施例1方法制备；

方法3：以bas偶联胰高血糖素做为免疫抗原制备胰高血糖素兔多抗

方法4：以bas偶联胰高血糖素做为免疫抗原制备鼠多抗；

表1

依据现有文献的报道，在制备多抗时klh作为载体蛋白偶联半抗原的免疫原性要好于bsa偶联半抗原，但是从上表可以看出，在制备胰高血糖素多抗时，与现有的常识并不一致，本发明方法所产生的抗体量是多于方法2的，效价一致。

同时，与兔多抗和鼠多抗相比，虽然在效价上不如，但是在抗体量上，每一个鸡蛋的抗体量都远大于每只兔子和小鼠的抗体量，而免疫产蛋母鸡一次可产多枚蛋，总体的抗体量远远大于普通方法的鼠多抗或兔多抗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。