与猪多个经济性状相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及与猪多个经济性状相关的分子标记，具体地，涉及与猪100公斤体重背膘厚、眼肌面积、瘦肉率相关的snp分子标记、其应用以及该分子标记在育种中的应用。

背景技术：

我国是一个养猪大国，猪肉产量和质量的市场需求日益增加，提高猪肉产量、改善猪肉胴体质量，成为育种科学家长期以来不断探索的工作。早期的育种工作主要集中于猪的表型选择，随着基因组工作的不断推进和遗传标记的广泛开发，分子选择正逐渐成为可靠而有效的选择方法。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)标记是第三代分子标记，是指在基因组dna序列上有单个碱基的突变而产生的一种多态性，这种突变包括单碱基的颠换、转换、插入和缺失。snp具有量大、高频率、低突变率等优点，广泛应用于基因组分析、生物信息自动化检测、简单和复杂疾病的遗传研究、畜牧育种标记及全球种族遗传学等研究。分子标记辅助选择育种，是在分子水平上对目标性状进行选择，可以不受环境影响，通过遗传背景选择，减少连锁累赘，从而加速育种过程及精准度。

全基因组关联分析(genome-wideassociationstudies，gwas)是畜禽经济性状遗传改良和机理解析的重要方法。随着二代测序技术的发展，全基因组重测序和简化基因组测序技术成为高通量snp分型的有力工具，gbs(genotyping-by-sequencing)是简化基因组测序的经典代表，是一种高效的全基因组snp分型方法，可以从群体中直接鉴定snp并进行分型，能以较低的成本获得几万到几十万不等的snp分型信息，已被广泛应用于动植物的分子标记开发、群体遗传分析、全基因组关联分析以及基因组选择育种等研究中(dedonatoetal.，2013；elshireetal.，2011；heetal.，2014)。

猪的背膘厚表示脂肪多少，背膘厚度越厚瘦肉率越低，相反，则瘦肉率高。瘦肉率指猪含有的瘦肉量，瘦肉所占的比率，良种猪的瘦肉率会比较高。猪眼肌面积是指猪最长机的横断面面积，猪个体的瘦肉率越高，眼肌面积越大。以上三个性状均与家猪产肉性能有强相关性，在育种中具有重要的研究意义。利用优化的gbs技术对猪群体进行gwas研究，有助于快速找到影响猪重要经济性状的有意义的分子标记，为猪的标记辅助选择育种提供有利的理论依据。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供与猪经济性状相关的snp分子标记。

本发明的第二个目的是提供该snp分子标记的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

测定并记录杜洛克猪的重要经济性状，利用优化的gbs技术对3702头杜洛克猪体进行gwas研究，得到了一个与猪100公斤体重背膘厚、100公斤体重眼肌面积、100公斤体重瘦肉率显著相关的snp位点，该snp位于基因组版本ensemblsscrofa10.2的chr7：35150544，该分子标记的多态性为t和g；所述经济性状为背膘厚、眼肌面积和瘦肉率(chr7：35150544)。统计该snp位点在重测序的地方猪种(金华猪、五指山猪、陆川猪、梅山猪、荣昌猪、莱芜猪、二花脸猪、河套猪和民猪)与商品猪种(杜洛克猪、长白猪、约克夏猪和杜长大猪)中的snp频率，发现其snp频率分布在地方猪种和商品猪种中存在显著差异，商品猪中t为优势等位基因，地方猪中g为优势等位基因。

具体地，所述snp分子标记位于seqidno.1所示的核苷酸序列中第101位碱基。

由此，得到了一种与猪多个经济性状相关的snp分子标记，在瘦肉率低的群体中，通过选择等位基因t的个体，可以提高群体的瘦肉率。

进一步地，本发明提供了所述snp分子标记在猪的标记辅助选择育种中的应用。

所述应用具体体现为一种利用所述snp分子标记对猪进行辅助育种的方法，可包括以下步骤：

(1)检测样品猪在所述snp分子标记的基因型；

(2)选择具有优势等位基因基因型的样品猪进行优势品系的选育。

作为优选，选择基因型为t/t的猪进行选育。

其中，所述优势品系主要表现为低背膘厚、眼肌面积大和瘦肉率高。

进一步地，所述步骤(1)可采用直接测序，或先扩增含所述snp位点的片段再检测的方式进行，例如，设计引物，从seqidno.1所示的序列中扩增出含有所述snp分子标记的片段，再检测该位点上的等位基因。

本发明还提供了所述snp分子标记在鉴定低背膘厚、眼肌面积大和瘦肉率高猪种中的应用。

另一方面，用于扩增含有本发明所述snp分子标记的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对的作用为：从seqidno.1所示的序列中扩增出含有所述snp位点的片段。

本发明的有益效果在于：通过优化的gbs技术对3702头具有重要经济性能记录的杜洛克猪群体进行gwas研究，通过对gwas结果的分析得到一个与猪主要经济性状显著相关的snp(chr7：35150544)位点，对这个位点在中国地方猪种及商品猪种中进行snp频率分析，发现其snp频率分布在地方猪种和商品猪种中存在显著差异，商品猪中t为优势等位基因，地方猪中g为优势等位基因。商品猪比地方猪增重快、瘦肉率高，说明这个snp位点可作为分子标记应用于优良猪种的选育。在瘦肉率低的群体中，通过选择等位基因t的个体，可以提高群体的瘦肉率。本发明通过检测snp分子标记能够早期、快速、低成本、有效的预测猪瘦肉率高低与否，在猪种改良方面具有广阔的应用前景，并能够取得优异的经济价值。

附图说明

图1a为猪100kg体重背膘厚、图1b为100kg体重眼肌面积，图1c为100kg体重瘦肉率gwas结果的曼哈顿图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1猪经济性状全基因组关联分析

1.试验材料

以杜洛克猪纯种群体为研究对象，收集2007年8月至2016年1月出生的33,960头个体(12,987头公猪和20,973头母猪)的生产性能记录用于本研究。常规性能测定严格按照猪场内部规范进行，100kg体重背膘厚(backfatthicknessat100kgliveweight，bf)、100kg体重眼肌面积(loinmuscleareaat100kgliveweight，lma)、100kg体重瘦肉率(leanmeatpercentageat100kgliveweight，lmp)。

2.试验方法

2.1100kg体重背膘厚、眼肌面积、瘦肉率测定性状：当猪只体重达到100±5kg时，开始进行终测；使用alokassd-500型b超仪测定倒数3-4肋间处的背膘厚、眼肌面积，并估计瘦肉率并将其校正到100kg体重时的数值。测量时探头、探头模及被测部位应紧密，但不要重压；探头直线平面与猪背正中线纵轴面垂直，不可斜切；在识别超声波影像时，首先确定皮肤界面、脂间结缔组织和背最长肌肌膜所产生的强回声影带，然后确定眼肌四周肌膜的强回声影像，以确定眼肌面积影带。

2.2基于gbs技术的猪全基因组snp分型方法

通过模拟酶切猪基因组，预测了36种常见的ⅱ型限制性内切酶以及24种双酶切组合在猪基因组中的酶切效果；根据研究目的和群体特点，选择ecori-mspi双酶切组合用于猪的gbs建库，并对gbs实验和分析流程进行了优化，建立了基于gbs技术的猪全基因组snp分型方法。通过对杜洛克3757头猪进行gbs测序，鉴定到的102,254个snp覆盖了猪的整个基因组。

2.3全基因组关联分析对3702头杜洛克猪群体的100kg体重背膘厚(bf)、100kg体重眼肌面积(lma)、100kg体重瘦肉率(lmp)进行了全基因组关联分析。

2.4snp质控为了获得可靠的gwas结果，采用以下条件进行质控：(1)maf≥0.05；(2)hwe≥10e-6；(3)每个snp的两种纯合子个体数均≥30。

2.5与经济性状显著相关的snp位点

基因组水平显著位点的检测，采用独立标记数进行bonferroni校正，独立标记数的计算使用plinkindep-pairwise命令获得，得到bonferroni基因组水平5％显著水平的p值为0.05/14,084＝3.55×10^-6，而潜在的关联的p值阈值为1.0/14,084＝7.10×10⁵。

根据该标准，得到一个与猪多种经济性状(100kg体重背膘厚、眼肌面积、瘦肉率)达到bonferroni校正的5％基因组水平显著的snp位点(p<10^-5.45)。

3.结果与分析

本发明以杜洛克群体为对象，利用优化的gbs测序获得的102,254个snp对猪的三个重要性状进行了gwas分析。确定了一个与猪100kg体重背膘厚、100kg体重眼肌面积和100kg体重瘦肉率三个生产性状的显著相关的snp(chr7：35150544)位点，如图1a-图1c所示。

实施例2snp标记(chr7：35150544)在不同品种猪中的频率分布

1试验材料

地方猪种：6头莱芜猪，5头二花脸猪，6头河套猪，6头民猪，5头金华猪，6头五指山猪，6头陆川猪，14头梅山猪，6头巴马香猪和9头荣昌猪。商品猪种包括：16头杜洛克猪，12头长白猪、8头约克夏猪和36头杜长大猪。

2试验方法

2.1基因组dna的提取

采用qiagen公司的giaampdnamini试剂盒提取基因组dna，具体操作步骤如下：

(1)向1.5ml的离心管中加入180μl的atl缓冲液，再加入20μl蛋白酶k，混匀；

(2)取20mg左右的耳组织样品放入上述溶液中，55℃消化8h；

(3)向消化好的组织液中加入3μl的rnasea，37℃恒温水浴锅中放置30min，目的是降解组织溶液中的rna；

(4)再向溶液中加入200μlal溶液，旋涡振荡混匀后放入70℃水浴锅中消化10min；待离心管恢复至室温，加入200μl无水乙醇，再次涡旋震荡混匀；

(5)将上述溶液全部加入dna吸附柱中，室温放置2min后，13000rpm离心1min；

(6)离心结束后，弃滤出液，并将吸附柱放进另一个新的2ml收集管中，加入500μlpw1溶液，13000rpm离心1min；

(7)离心结束后，再将吸附柱放进另一个新的2ml收集管中，加入500μlpw2溶液，13000rpm离心3min；

(8)倒掉收集管中的溶液，用纸巾擦净收集管管口的液体，再次将吸附柱放在收集管中，13000rpm离心2min；

(9)将dna吸附柱的盖子打开，放入已编好号的1.5ml离心管中，室温放置2min，使管中残留的乙醇挥发完；

(10)向吸附柱的正中心加入120-150μlae缓冲液，室温放置2min后，13000rpm离心1min，所得溶液即为基因组dna。基因组dna经过1％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，用nanodrop定量浓度；再将浓度统一稀释到50ng/μl，用于下一步实验。

2.2snp(chr7：35150544)在各品种猪全基因组重测序数据中的频率分布

将各品种猪基因组dna送测序，统计snp(chr7：35150544)在以上地方猪种和商品猪种重测序数据中的频率分布。

3结果与分析

snp(chr7：35150544)在不同地方猪种和商品猪种中的snp频率分布结果如表1所示，在地方猪种和商品猪种中存在显著差异。商品猪中t为优势等位基因，地方猪中g为优势等位基因。

表1snp(chr7：35150544)在不同地方猪种和商品猪种中的snp频率

由此，得到了一种与猪经济性状(100kg体重背膘厚、眼肌面积、瘦肉率)相关的snp分子标记，在瘦肉率低的群体中，通过选择基因组版本ensemblsscrofa10.2的chr7：35150544等位基因t的个体进行育种，可以提高育种群体的瘦肉率。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>与猪多个经济性状相关的snp分子标记及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>201

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttaacacaggcttcacttgatcccatgaggagtgtggaggctgggatggcacttccgtgt60

tgtcgtgaattcaggatccagggatccaggcctgtgctatgggatgtgagctgtcattgg120

atctctgtgaatcccactgctatgggattttggtgaacctgtcttttggtggctgtgtgt180

tctccttactgatgggtgtcg201