一种葡萄snRNAU6基因及其引物和应用的制作方法

本发明涉及一种葡萄snrnau6基因、进行实时荧光定量pcr扩增该基因的引物以及该基因作为葡萄mirna定量pcr检测的内参基因的应用。

背景技术：

mirna（microrna)是一类在生物界中广泛存在的小分子非编码单链rna，长约21～24nt，它能通过降解或抑制互补的靶mrna来进行转录后基因表达调控，并且在生物的各个发育时期和不同的组织器官中广泛表达，参与到生物的各种生理活动中，因其在生物中的重要性，近几年国内外科学家对mirna的研究倍加重视。对葡萄mirna的研究有助于推动葡萄种植业的发展。葡萄中只报导了187条mirna，对mirna的定量研究的较少。

目前对mirna的表达分析主要有高通量测序，基因芯片和实时荧光定量pcr法三种。其中，高通量测序和基因芯片法为高通量监测的方法，成本很高，不适于少量mirna的功能分析，并且需要利用实时荧光定量pcr方法来验证。而基于sybrgreen染料荧光定量pcr的mirna相对定量法表达分析有着操作相对简单，成本较低，灵敏度高的优势，广受研究人员的欢迎。在相对定量中，内参的选择尤为重要。目前内参的选择大多数采用一些表达相对恒定的管家基因，如snrnau6，5srrna等。u6基因是一种核剪切子rna，参与到pre-mrna的加工剪切，它的序列比较保守，在不同的物种中同源性高，相比较其他内参基因，snrnau6更普遍的作为mirna定量分析的内参基因。但是葡萄snrnau6基因序列和引物尚未有相关报道，更没有以葡萄u6基因作为内参基因来对葡萄mirna进行定量的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供葡萄snrnau6基因和扩增该snrnau6基因的引物，本发明通过研究首次得到葡萄snrnau6基因并提供了扩增该基因的引物，该引物能准确的特异性的扩增出葡萄snrnau6基因，该基因在葡萄各个组织、冷胁迫诱导下的表达均很稳定，为葡萄mirna定量pcr检测提供了可用的内参。

本发明的另一目的是提供该葡萄snrnau6基因作为葡萄mirna的定量pcr检测的内参基因的应用，还提供了采用实时荧光定量pcr检测葡萄mirna的方法。该方法采用本发明snrnau6基因为内参，所得表达结果与mirna组高通量测序表达谱高度吻合，准确率高。

葡萄snrnau6基因属于一种非编码的小rna，在目前公布的葡萄基因组中没有关于非编码小rna的信息。虽然u6基因在各个物种中有一定的保守性，但不同物种的u6基因还是存在其本身的特异性，要对葡萄的mirna进行实时荧光定量pcr检测，必须使用葡萄的u6基因作为内参才可以，采用其他物种的u6基因不可行，存在准确率无法保障的问题。并且，不同物种的u6基因序列之间虽然相似度较大，但是即使一个碱基的差别也会影响引物设计的精确性，只有针对具体的基因序列设计出的特定引物才能实现对序列的准确扩增，不同物种u6基因的引物也无法通用。发明人通过小rna组高通量测序、同源克隆结合的方法从葡萄中首次鉴定得到了葡萄snrnau6基因，并设计了该基因的pcr引物，可以方便快捷的扩增出该基因，为其作为内参基因提供了技术支持。

本发明具体技术方案如下：

一种葡萄snrnau6基因，其核苷酸序列为：gtctcttcggagacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcacaaatcgagaaatggtccaaatttttttt，如seqidno:1所示。

扩增上述葡萄snrnau6基因的引物，该引物对应的正向引物和反向引物如下：

正向引物：5'gagacatccgataaaattggaacga3'，如seqidno:2所示。

反向引物：5'ggggccatgctaatcttctctgtat3'，如seqidno:3所示。

本发明上述葡萄snrnau6基因可以作为葡萄mirna的定量pcr检测的内参基因，将其作为内参基因分析的mirna的表达结果与mirna高通量测序表达谱高度吻合，准确率高。在检测时，可以通过上述引物方便快捷的得到葡萄snrnau6基因。

进一步的，所述定量pcr检测方法为实时荧光定量pcr检测。

本发明还具体提供了一种葡萄mirna实时荧光定量pcr检测方法，该方法包括以下步骤：

（1）取葡萄待检组织，提取其中的mirna，利用反转录试剂盒，反转录获取cdna；

（2）进行实时荧光定量pcr，以葡萄snrnau6基因为内参，对葡萄mirna表达量进行定量分析，得到mirna在不同样本的ct值。

进一步的，可以采用2-δδct法处理葡萄mirna数据，根据ct值对mirna进行定量分析。

进一步的，葡萄待检组织可以是葡萄的茎、叶、花、果、卷须等组织，选择范围广。

进一步的，可以采用trizol法提取葡萄mirna。

进一步的，实时荧光定量pcr反应体系为：cdna2ul，正向引物1ul，反向引物1ul，mix10ul，ddh2o6ul，总共20μl。

进一步的，pcr反应条件为：95℃30秒后，连续40个循环：95℃5秒；60℃30秒。

本发明的优点如下：

1、本发明首次鉴定得到了葡萄snrnau6基因，并设计了该基因用于实时荧光定量pcr的引物。实验证明，该基因及引物可以用于葡萄基因及葡萄mirna的实时荧光定量pcr分析，该葡萄snrnau6基因在葡萄各个组织及冷胁迫条件下表达量稳定，可靠性较好。本发明snrnau6基因可以作为实时荧光定量pcr的内参基因，u6基因是目前公认的最适合用于作为mirna荧光定量的内参基因，以snrnau6为内参做出的表达结果与mirna测序表达谱高度吻合，有利于少量mirna的表达分析，操作相对简单，成本较低，灵敏度高。

2、该葡萄snrnau6基因引物特异性好，在实际使用中稳定、可靠、操作方法简单。该引物可以用于检测不同组织、不同条件胁迫下葡萄mirna的实时荧光定量pcr检测。此外，该引物还可以用于其他小rna（smallrna）的检测，如sirna。

3、本发明对snrnau6进行扩增所用的荧光定量pcr的方法与其他mirna的荧光定量pcr的方法相同，引物的退火温度是比较常用的58-60℃，这样可以与其他mirna的荧光定量pcr在同一批次进行，这保证了实验条件的一致性，可靠性，大大降低了不同批次操作造成的条件性误差。

附图说明

图1不同引物扩增的pcr产物的凝胶电泳图。

图2葡萄叶、茎、花扩增所得的snrnau6基因的溶解曲线。

图3在葡萄不同组织中扩增得到snrnau6基因的凝胶电泳图。

图4正常环境和冷胁迫环境下葡萄snrnau6基因扩增曲线图，其中a为正常环境下葡萄snrnau6基因的扩增曲线图，b为冷胁迫环境下葡萄snrnau6基因的扩增曲线图，c为a和b的扩增曲线的结合图。

图5葡萄mir156c基因正常环境和冷胁迫环境下的荧光定量检验结果。

图6葡萄mir172d基因正常环境和冷胁迫环境下的荧光定量检验结果。

图7葡萄mir3624-5p基因正常环境和冷胁迫环境下的荧光定量检验结果。

图8葡萄mir3636-5p基因正常环境和冷胁迫环境下的荧光定量检验结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明葡萄snrnau6基因的获取、引物的设计以及应用进行更详尽的解释和说明，以便本领域技术人员更好的理解本发明。下述说明仅为示例性的，并不对本发明保护范围造成限制。下述实施例中所使用的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

根据同源序列搜素，从葡萄基因组中获取推测的u6基因序列，从候选u6基因的保守区域设计引物，获得snrnau6基因的部分序列，再利用race技术获得其全长序列，所得序列送至上海生工公司进行sanger法单基因测序，经测序得到序列结果如下：

gtctcttcggagacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcacaaatcgagaaatggtccaaatttttttt

该snrnau6基因为106bp。将获得的最终snrnau6基因与花生、玉米、番茄的snrnau6基因进行同源性比对，如下所示，横线部分的基因序列在各物种中相同。经过比对可以看出，本发明snrnau6基因与这三个物种的snrnau6基因具有高度的保守性，从而确认最终所得的基因确实是snrnau6基因。

玉米snrnau6：

gtctcttcggagacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcacaaatcgagaaatggtccaaattttttt

番茄snrnau6：

catccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcacaaatcgagaaatggtccaaattttttt

花生snrnau6：

cgtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcacaaatcgagaaatggtccaaattttttt

葡萄snrnau6：

gtctcttcggagacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcacaaatcgagaaatggtccaaatttttttt

实施例2

根据所得的snrnau6基因全长，设计荧光定量引物，引物设计要求：gc含量>40%，引物序列长度为20±5bp，退火温度为58-60℃。

根据引物需求，通过大量筛选得到五对葡萄snrnau6基因候选引物，引物送至上海生工公司进行合成，引物序列如下：

采用上述5对候选引物对葡萄叶中的snrnau6基因进行扩增，方法如下：

1、实验采用济南地区的赤霞珠品种的葡萄，采集葡萄嫩叶，用液氮速冻待用；

2、trizol法提取葡萄样品的rna，具体步骤如下：

a)称取所需样品约100mg，液氮下迅速将样品研磨成粉末；

b)每100mg样品加入1.3mltrizol，于漩涡振荡器上混匀，室温静置5min；

c)4ºc，12000×g离心10min，将上层水相转入新的1.5mlep管（约400~500ul），室温静置5min，使组织细胞充分裂解；

d)每1mltrizol加入200µl氯仿，盖紧管盖，漩涡振荡器上振荡混匀，室温静置3-5min，使其自然分相；

e)4ºc，12000×g离心10min，混合物分成三层：下层红色为苯酚－氯仿有机相，中间蛋白层和无色上层水相，rna主要集中在水相；

f)(植物组织可选择先用酸性水饱和酚/氯仿(5:1)抽提水相，有助于去除糖蛋白和部分基因组)转移上层水相（约400~500µl），加入水相等体积的氯仿/异戊醇混合液(氯仿：异戊醇=24:1)，混匀后，冰上静置5min，4ºc，12000×g离心10min；

g)必要时重复一次氯仿/异戊醇抽提，至中间层较干净；

h)向转移的上清中加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h；

i)4ºc，13600rpm离心20min，弃掉上清；

j)rna沉淀用1.0ml75％乙醇漂洗两次，每次静置3min，期间颠倒洗涤，4ºc13600rpm离心3min；

k)移去残留的乙醇，将沉淀置于超净工作台吹干，用30～50µlnuclease-freewater溶解rna沉淀，必要时可于55～60ºc下孵育10min助溶。

3、反转录：利用反转录试剂盒（onestepprimescriptmirnacdnasvnthesiskit，购自takara公司），按照说明书将获得的rna加polya尾后反转成cdna，所用仪器为bioradpcr仪（biorad公司)，具体步骤如下：

1)反应体系如下：2×mirnareactionbuffermix10μl，0.1％bsa2μl，mirnaprimescriptrtenzymemix2μl，smallrnas1μl，rnasefreedh2o5μl，共20μl。(均由上述takara试剂盒提供)。

2)反应条件如下：37℃(加尾和反转录60min)，85℃(酶的失活5s)。

3)向得到的反转录反应液中添加rnasefreedh2o补足至100μl。

4、pcr反应：在abi^tm7500荧光定量仪中进行，具体条件如下：

实时荧光定量pcr反应体系为：正向引物1ul，反向引物1ul，mix（faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)）10ul，ddh2o6ul，cdna模板2ul,总共20μl。每个体系做3个技术性重复。

pcr反应条件为：95℃30秒；然后连续40个循环：95℃5秒和60℃30秒。

将扩增得到的pcr产物用3％的琼脂电泳检测，结果如图1所示，从图中可以看出，仅u6a引物扩增得到了预期的snrnau6基因，其他引物均没有扩增得到目的基因。因此以u6a引物作为扩增snrnau6基因的引物，序列如下：

f（正向引物）:5'gagacatccgataaaattggaacga3'

r（反向引物）:5'ggggccatgctaatcttctctgtat3'。

实施例3

对葡萄不同组织和不同条件下的snrnau6基因进行扩增和表达量测试，方法如下：

1、所用的葡萄样品：实验采用济南地区的赤霞珠品种的葡萄，采集其叶、花、茎、果、卷须部位，速冻作为样品，待用；

同时，将葡萄叶在4℃低温下处理24h，作为葡萄冷胁迫样品，与正常情况下的葡萄叶片分别速冻，待用。

2、trizol法提取葡萄样品的rna，同实施例2。

3、反转录：利用反转录试剂盒（onestepprimescriptmirnacdnasvnthesiskit，购自takara公司），按照说明书将获得的rna加polya尾后反转成cdna，同实施例2。

4、pcr反应：在abi^tm7500荧光定量仪中进行，具体条件如下：

pcr反应体系为：正向引物1ul，反向引物1ul，mix（faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)）10ul，ddh2o6ul，cdna模板2ul,总共20μl。每个体系做3个技术性重复。

pcr反应条件为：95℃30秒；然后95℃5秒和60℃30秒连续40个循环。

采用abi^tm7500荧光定量仪自动制作溶解曲线，图2为从葡萄叶中、茎、花中扩增所得的pcr产物的溶解曲线，从图中可以看出各个组织溶解曲线均为单峰，这说明引物扩增效率很好，特异性很好，无非特异扩增。

采用上述方法从葡萄的叶、果、花、茎、卷须中分别扩增出pcr产物，然后取2μl的pcr产物，分别用3％的琼脂电泳检测，结果如图3所示。从图中可以看出，在葡萄的不同组织中都能扩增得到snrnau6基因片段，并且条带亮度相似，说明snrnau6基因在葡萄各个组织中都能表达，且表达稳定，可以作为内参基因。此外，不同组织中的pcr扩增条带无杂带，说明本发明引物扩增效率很好，特异性很好。

按照上述方法分别以正常情况下的葡萄叶片和冷胁迫处理的葡萄叶片为样本，进行snrnau6基因的扩增，所得扩增曲线如图4所示，其中图a为正常环境下葡萄snrnau6基因的扩增曲线图，图b为冷胁迫环境下葡萄snrnau6基因的扩增曲线图，图c为图a和b的扩增曲线的结合图。从图中能够明确看出，snrnau6基因在正常环境下和冷胁迫环境下的表达情况相似，snrnau6基因在冷胁迫环境下表达量稳定，可靠性好。

实施例4

以本发明得到的snrnau6基因为内参基因，分别对葡萄mir156c、葡萄mir172d、葡萄mir3624-5p和葡萄mir3636-5p四个基因在正常环境下和冷胁迫环境下的表达量进行荧光定量pcr检测，方法如下：

1、取葡萄叶，进行速冻处理，同时将葡萄叶在4℃低温下处理24h，速冻处理，得到正常环境下和冷胁迫环境下的样本，待用；

2、按照上述实施例2的方法，采用trizol法提取正常环境下和冷胁迫环境下的葡萄样品的rna，并利用反转录试剂盒（onestepprimescriptmirnacdnasvnthesiskit，购自takara公司）将获得的rna加polya尾后反转成cdna；

3、设计葡萄mir156c、葡萄mir172d、葡萄mir3624-5p和葡萄mir3636-5p的扩增引物，如下：

4、使用abi^tm7500荧光定量仪，分别对上述葡萄mir156c、葡萄mir172d、葡萄mir3624-5p和葡萄mir3636-5p四种基因进行实时荧光定量pcr检测，具体条件如下：

pcr反应体系为：葡萄mirna和u6基因的正向引物1ul，葡萄mirna和u6基因的反向引物1ul，mix（faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)）10ul，ddh2o6ul，cdna模板2ul，总共20μl。每个体系做3个技术性重复。

pcr反应条件为：95℃30秒；然后95℃5秒和60℃30秒连续40个循环。

5、分别记录各个基因在正常环境下和冷胁迫环境下所得的ct值，以snrnau6基因为内参基因，各基因在正常环境下和冷胁迫环境下的相对内参基因的表达量如图5-8所示。进一步的，可以采用2-△△ct法进一步分析各基因在冷胁迫环境下的表达差异，△△ct＝(ctmirna-ctu6)冷胁迫-(ctmirna-ctu6)正常环境。

同时，利用高通量测序上述葡萄mir156c、葡萄mir172d、葡萄mir3624-5p和葡萄mir3636-5p四种基因在正常环境下和冷胁迫环境下的表达谱。测试结果如下表所示：

从图5-8可以看出，这四种基因在冷胁迫下表达量均上升。同时，高通量测试结果也显示这四种基因在冷胁迫下表达量也上升，与实时荧光定量pcr检测结果吻合。

序列表

<110>山东省葡萄研究院

<120>一种葡萄snrnau6基因及其引物和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>106

<212>dna

<213>vitisviniferal.

<400>1

gtctcttcggagacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctg60

cgcaaggatgacacgcacaaatcgagaaatggtccaaatttttttt106

<210>2

<211>25

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