本发明涉及一种人类基因组dna基因型检测的体外诊断试剂盒，尤其涉及mthfr和mtrr基因检测试剂盒及其用途，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：叶酸是饮食中重要的甲基供体，参与dna甲基化和dna合成通路。叶酸缺少会引起人dna中的尿嘧啶错误插入，及染色体断裂，从而导致基因组的不稳定性和突变概率的增加。叶酸代谢通路异常，会导致高同型半胱氨酸败血症。高同型半胱氨酸败血症是多种疾病的危险因子，会导致各种增加的风险，如血管和神经疾病，妊娠并发症，男性不育，新生儿缺陷，糖尿病，肾脏疾病，骨质疏松症，神经精神疾病和癌症。mthfr(5,10-methylenetetrahydrofolatereductase)基因，编码5,10亚甲基四氢叶酸还原酶，位于第一号染色体1p36.3位置。mthfr全长19.3kb，共有外显子12个，mrna全长7,105bp，编码657个氨基酸残基组成的蛋白；能够催化5,10-mthfr还原为5-甲基四氢叶酸，作为一个甲基供体，参与同型半胱氨酸到甲硫氨酸的甲基化。mthfr基因突变主要发生在677和1298位点，677位点(c>t)突变会使基因编码的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的活性发生不同程度的变化，677tt使酶活性降低几乎为70％左右，677ct则是降低了35％的活性。mthfr基因的1298位点，其多态性导致异亮氨酸被甲硫氨酸替换，从而导致同型半胱氨酸再甲基化的速率。而据相关文献研究，1298位点的突变可以和677位点的突变发生协同效应，导致5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的活性进一步的降低。mtrr(5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferasereductase)基因，编码甲硫氨酸合成酶还原酶，位于染色体5p15.3-p15.2位置，mtrr基因全长32021kb，mrna全长3274bp，共有15个外显子，编码具有726个氨基酸的蛋白质。mtrr编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。mtrr基因的66位点(a>g)突变会对叶酸dna甲基化代谢途径产生影响。现有的针对mthfr和mtrr基因检测的体外诊断试剂盒大多采用单重荧光pcr反应，或者直接采用直接测序法，焦磷酸测序法等。若要完成mthfr和mtrr基因3个位点基因型的检测需要分别进行一个荧光pcr反应，在面对大规模样本检测时，无疑会耗费大量的人力物力，也会延长诊断时间；测序法则操作繁琐耗时且灵敏度低。因此，目前急需建立一种特异性好，灵敏性高的能够实现单一反应管中同时检测3个位点基因型的方法，以期能够更好、更快的用于mthfr和mtrr基因3个位点基因型的检测。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种能够在单一反应管中同时检测mthfr和mtrr基因3个位点基因型检测的试剂盒，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优点。为了达到上述目的，本发明采用了以下的技术手段：本发明是一种人类mthfr和mtrr基因检测试剂盒，其特征在于，包括以下各组分：mthfr677/mthfr1298/mtrr66三重检测液以及可选的以下组分：核酸扩增反应液、酶混合液、阳性对照和空白对照；其中，所述的mthfr677/mthfr1298/mtrr66三重检测液包括以下3组组分：组分(1)：由检测mthfr基因677位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为seqidno.1和seqidno.2所示；所述探针的碱基序列如seqidno.3所示，其中，seqidno.3的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；组分(2)：由检测mthfr基因1298位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为seqidno.4和seqidno.5所示；所述探针的碱基序列如seqidno.6所示，其中，seqidno.6的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；组分(3)：由检测mtrr基因66位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为seqidno.7和seqidno.8所示；所述探针的碱基序列如seqidno.9所示，其中，seqidno.9的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。其中，优选的，所述荧光报告基团选自fam、vic、rox、cy3或cy5荧光报告基团，且组分(1)、组分(2)以及组分(3)选自不同的荧光报告基团；荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1和tamra中的任意一种或几种，但要求其能够淬灭标记在同一条探针上的荧光报告基团。本发明对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果：优选的，在本发明的一些实施方案中，组分(1)中引物及探针之间的配比为：seqidno.1所示的引物:seqidno.2所示的引物:seqidno.3所示的探针＝400nm:400nm:200nm。优选的，在本发明的一些实施方案中，组分(2)中引物及探针之间的配比为：seqidno.4所示的引物:seqidno.5所示的引物:seqidno.6所示的探针＝400nm:400nm:200nm。优选的，在本发明的一些实施方案中，组分(3)中引物及探针之间的配比为：seqidno.7所示的引物：seqidno.8所示的引物:seqidno.9所示的探针＝400nm:400nm:200nm。优选的，在本发明的一些实施方案中，所述的核酸扩增反应液包括以下组分中的任意一种或多种的组合：pcr缓冲液、mgcl2、datp、dttp、dctp、dgtp、dutp、以及去rna酶水。优选的，在本发明的一些实施方案中，所述的酶混合液包括以下组分中的任意一种或多种的组合：dna聚合酶和udg酶。dna聚合酶在pcr扩增中起着非常重要的作用，为了达到更好的效果，更优选的，所述dna聚合酶是化学修饰酶，所述udg酶是e.coli尿嘧啶-dna糖基化酶。优选的，在本发明的一些实施方案中，所述的阳性对照为所述的阳性对照为6种质粒dna，所述6种质粒dna分别为4种不同的mthfr等位基因和2种不同的mtrr等位基因，所述的空白对照为去rna酶水。优选的，在本发明的一些实施方案中，所述的检测试剂盒进行人类mthfr和mtrr基因检测时，按照以下步骤进行：(1)采用核酸提取试剂盒提取样本的基因组dna；(2)准备以下组分：核酸扩增反应液9μl，酶混合液1μl，mthfr677/mthfr1298/mtrr66三重检测液8μl，样本dan2μl；(3)荧光pcr扩增及熔解曲线分析，按照以下程序进行：扩增(37℃5min；95℃15min；95℃10s，55℃40s，共进行45个循环)，然后进行熔解曲线分析(95℃10s，50-72℃0.03℃/s)；(4)结果判定：扩增结束后，根据熔解曲线判断样本的mthfr和mtrr基因型；其中，优选的，当seqidno.3的5′端标记有荧光报告基团fam，3′端标记有荧光淬灭基团bhq1，seqidno.6的5′端标记有荧光报告基团vic，3′端标记有荧光淬灭基团bhq1，seqidno.9的5′端标记有荧光报告基团rox，3′端标记有荧光淬灭基团bhq1；在fam通道内熔解曲线为单峰且tm值为65.00±1.00℃，判断为mthfr677位点为野生型，熔解曲线为单峰且tm值为55.50±1.00℃，判断为mthfr677位点突变型，熔解曲线为双峰且tm值分别为65.00±1.00℃和55.50±1.00℃，则为mthfr677位点杂合型(如图1所示)；在vic通道内熔解曲线为单峰且tm值为58.00±1.00℃，判断为mthfr1298位点为野生型，熔解曲线为单峰且tm值为66.50±1.00℃，判断为mthfr1298位点突变型，熔解曲线为双峰且tm值分别为58.00±1.00℃和66.50±1.00℃，则为mthfr1298位点杂合型(如图1所示)；在rox通道内熔解曲线为单峰且tm值为56.50±1.00℃，判断为mtrr66位点为野生型，熔解曲线为单峰且tm值为63.00±1.00℃，判断为mtrr66位点突变型，熔解曲线为双峰且tm值分别为56.50±1.00℃和63.00±1.00℃，则为mtrr66位点杂合型(如图1所示)。更进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备人类mthfr和mtrr基因检测试剂中的应用。相较于现有技术，本发明的有益效果是：使用本发明提供的mthfr和mtrr基因检测试剂盒能够在单个反应管中同时检测出mthfr基因677和1298位点以及mtrr基因66位点的基因型，解决了现有产品无法在单个反应管中同时检测mthfr和mtrr基因3个位点基因型的问题。此外，本发明提供的mthfr和mtrr基因检测试剂盒还具有操作简便、可重复性强、检测结果快速客观等优点，利于大规模推广使用。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明试剂盒检测样本的熔解曲线图；图2为本发明试剂盒的重复性检测的实验结果(mthfr677杂合型，mthfr1298杂合型，mtrr66杂合型)；图3为本发明试剂盒的灵敏度检测的实验结果；图4为本发明试剂盒的特异性检测的实验结果。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1人类mthfr和mtrr基因检测试剂盒的组装所述的试剂盒包括以下组分：(1)核酸扩增反应液：所述核酸扩增反应液由去rna酶水、10×pcr缓冲液、25mmmg2+、10mmdntps组成(表1)。表1核酸扩增反应液的组成试剂名称加入体积(μl)/50人份pcrbuffer100mgcl23100mmdatp2.5100mmdgtp2.5100mmdctp2.5100mmdutp1.25100mmdttp1.25去rna酶水337总体积450(2)酶混合液所述的酶混合液包括dna聚合酶、酶稀释液、udg酶。dna聚合酶在pcr扩增中起着非常重要的作用，包括逆扩增的效率和特异性，为了达到更好的效果，本发明优选采用taq热启动酶(表2和表3)。表2酶稀释液的配制taq酶稀释液组分加量(ml)终浓度1mtris-hclph9.0220mm1m氯化钾10100mm0.5m乙二胺四乙酸二钠盐0.020.1mm1mdl-二硫代苏糖醇0.11mm吐温200.20.2％(v/v)甘油5050％去rna酶水37.68/总体积100/按上表配好的酶稀释液，用ph计测其ph值，若ph值不是9.0，需用浓盐酸或氢氧化钠调至9.0(±0.1)，并用0.22μm滤器过滤除菌，于-20℃保存。表3酶混合液的组成试剂名称加入体积(μl)/50反应dna聚合酶30udg酶1酶稀释液19总计50(3)mthfr677/mthfr1298/mtrr66三重反应液所述的mthfr677/mthfr1298/mtrr66三重反应液包括以下3组组分：其中，所述的mthfr677/mthfr1298/mtrr66三重检测液包括以下3组组分：组分(1)：由检测mthfr基因677位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为seqidno.1和seqidno.2所示；所述探针的碱基序列如seqidno.3所示，其中，seqidno.3的5′端标记有荧光报告基团fam，3′端标记有荧光淬灭基团bhq1；seqidno.1所示的引物:seqidno.2所示的引物:seqidno.3所示的探针＝400nm:400nm:200nm。组分(2)：由检测mthfr基因677位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为seqidno.4和seqidno.5所示；所述探针的碱基序列如seqidno.6所示，其中，seqidno.6的5′端标记有荧光报告基团vic，3′端标记有荧光淬灭基团bhq1；seqidno.4所示的引物:seqidno.5所示的引物:seqidno.6所示的探针＝400nm:400nm:200nm；组分(3)：由检测mtrr基因66位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为seqidno.7和seqidno.8所示；所述探针的碱基序列如seqidno.9所示，其中，seqidno.9的5′端标记有荧光报告基团rox，3′端标记有荧光淬灭基团bhq1。seqidno.7所示的引物：seqidno.8所示的引物:seqidno.9所示的探针＝400nm:400nm:200nm。用于检测mthfr677/mthfr1298/mtrr66的引物及探针序列以及mthfr677/mthfr1298/mtrr66检测液组成如下表4及表5所示：表4用于检测的引物及探针表5mthfr677/mthfr1298/mtrr66三重检测液的组分试剂名称引物/探针浓度加入体积(μl)/50人份mthfr677上游引物100μm0.5mthfr677下游引物100μm4mthfr677探针100μm2mthfr1298上游引物100μm0.5mthfr1298下游引物100μm4mthfr1298探针100μm2mtrr66上游引物100μm0.5mtrr66下游引物100μm4mtrr66探针100μm2去rna酶水/380.5总体积/400(4)阳性对照阳性对照有6种质粒dna(2种不同的mthfr677位点等位基因、2种不同的mthfr1298位点等位基因和2种不同的mtrr66位点等位基因)混合配制液。阳性对照的配制如表6所示：表650ng/μl阳性对照的配制组分使用浓度体积(μl)mthfr-677cc质粒500ng/μl5mthfr-677tt质粒500ng/μl5mthfr-1298aa质粒500ng/μl5mthfr-1298cc质粒500ng/μl5mtrr-66aa质粒500ng/μl5mtrr-66gg质粒500ng/μl5te缓冲液/70终体积/100注：质粒载体均为puc57,插入的酶切位点均为ecorv。(5)空白对照去rna酶水。实施例2采用本发明实施例1的试剂盒对临床样本的检测试验1、样本处理(全血样本提取)取200μl全血样本，应用qiagen全血基因组dna提取试剂盒(qiaampdnabloodminikit，catno.:51104)，按照试剂盒说明书进行提取，获得样本dna。2、试剂准备采用实施例1制备得到的试剂盒进行反应体系的准备(表7)：表7反应体系配置表反应体系加量(μl)/1人份核酸扩增反应液9酶混合液1检测液8样本dna2总体积203、pcr扩增程序按照以下程序进行rt-pcr扩增：扩增(37℃5min；95℃15min；95℃10s，55℃40s，共进行40个循环)，然后进行熔解曲线分析(95℃10s，50-72℃0.03℃/s)；4、结果判定扩增结束后，根据熔解曲线判断样本的mthfr和mtrr基因型；其中，在fam通道内熔解曲线为单峰且tm值为65.00±1.00℃，判断为mthfr677位点为野生型，熔解曲线为单峰且tm值为55.50±1.00℃，判断为mthfr677位点突变型，熔解曲线为双峰且tm值分别为65.00±1.00℃和55.50±1.00℃，则为mthfr677位点杂合型(如图1所示)；在vic通道内熔解曲线为单峰且tm值为58.00±1.00℃，判断为mthfr1298位点为野生型，熔解曲线为单峰且tm值为66.50±1.00℃，判断为mthfr1298位点突变型，熔解曲线为双峰且tm值分别为58.00±1.00℃和66.50±1.00℃，则为mthfr1298位点杂合型(如图1所示)；在rox通道内熔解曲线为单峰且tm值为56.50±1.00℃，判断为mtrr66位点为野生型，熔解曲线为单峰且tm值为63.00±1.00℃，判断为mtrr66位点突变型，熔解曲线为双峰且tm值分别为56.50±1.00℃和63.00±1.00℃，则为mtrr66位点杂合型(如图1所示)。10个临床样本具体结果如下表8所示：表810个临床样本的检测结果试验例1本发明实施例1提供的试剂盒重复性实验结果为了检测本发明实施例1提供的mthfr677/mthfr1298/mtrr66检测试剂盒的重复性，用实施例1制备得到的核酸检测试剂盒检测阳性对照，重复检测10次。结果表明fam通道对mthfr677位点进行熔解曲线分析；vic通道对mthfr1298位点进行熔解曲线分析；rox通道对mtrr66点进行熔解曲线分析，都具有很好的重复性(如图2所示)。试验结果表明，本发明实施例1的试剂盒对于mthfr677/mthfr1298/mtrr66的诊断具有很好的重复性。试验例2本发明实施例1提供的试剂盒灵敏度实验结果对阳性对照进行10倍倍比稀释，获得浓度分别为5ng/μl,2ng/μl,1ng/μl,0.5ng/μl。实验结果表明本发明实施例1的试剂盒可检测至0.5ng/μl，并且随浓度减少熔解曲线也呈梯度改变(如图3所示)。试验结果表明，本发明实施例1的试剂盒对于mthfr677/mthfr1298/mtrr66的诊断具有高灵敏度。试验例3本发明实施例1提供的试剂盒特异性实验结果对特异性参考品t1～t5(具体信息见表9)为模板进行检测。实验结果表明本发明实施例1的试剂盒在检测上述特异性参考品时，检测结果均为野生型(如图4所示)。结果表明，本发明实施例1的试剂盒对于mthfr677/mthfr1298/mtrr66的检测或诊断具有高特异性。表9特异性参考品组成注：质粒载体均为puc57,插入的酶切位点均为ecorv。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>江苏硕世生物科技股份有限公司<120>人类mthfr和mtrr基因检测试剂盒及其用途<160>9<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1cctgaagcacttgaaggagaa21<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2caaagcggaagaatgtgtca20<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<400>3tgtctgcgggagccgatttcatcat25<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4ttctacctgaagagcaagtccc22<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gcaccgagaggtaaagaacg20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6ctgaccagtgaagcaagtgt20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7atgctacacagcagggacag20<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<400>8ccgttacagtggattttaccgt22<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<400>9tcgcagaagaaatgtgtgagca22当前第1页12