ed gene Expression system〉〉。
[0034] 实施例1携带有融合基因片段的乳酸菌表达载体的构建
[0035] 从GenBank中获得序列：片球菌素导肽基因和成熟大肠杆菌素V基因的序列，经过 密码子改造和优化，本发明的片球菌素导肽基因序列如SEQIDNO. 2所示，成熟大肠杆菌素 V基因序列如SEQIDN0.3所示。将片球菌素导肽基因和成熟大肠杆菌素V基因连接，连接 后的融合基因由生物公司合成如下序列，共338bp，如SEQIDNO. 1所示（两端分别添加了 NcoI和EcoRI酶切位点和保护碱基）合成的片段构建在pUCK载体上。使用NcoI和 EcoRI分别双酶切表达载体pi18148和携带合成片段的pUCK载体，然后使用DNA连接酶 连接过夜，将连接产物电转化乳酸乳球菌NZ9000,通过提取质粒和测序获得重组质粒，将其 命名为pll8148-ColV。
[0036] 实施例2构建重组植物乳杆菌菌株
[0037] 1、制备乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞
[0038] 用SGM17液体培养基培养乳酸乳球菌NZ9000, 30°C下培养至0D值到0. 2-0. 7。取 10ml菌液，于6000rpm，4°C离心8min，收集菌体；加入2ml预冷的0? 5mol/L鹿糖溶液（含 10%甘油）洗绦两次，6000rpm，4°C离心8min，弃去上清；用对应细胞培养液体积的1 %的预 冷0.5111〇1/1蔗糖溶液（含10%甘油）悬浮细胞，4(^1分装备用。
[0039] 2、重组质粒电转化乳酸乳球菌NZ9000
[0040] 取乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞40y1，与5y1实施例1获得的连接产物混合， 转移至2mm电转杯中，使用Bio-RadGenePulserXcell?型电转化仪，电击后加入lml复 苏培养基SGM17MC(SGM17,0. 5mol/L蔗糖，20mmol/L的MgCl2,2mmol/L的CaCl2)于 30°C培 养2h，取适量菌液涂布于含有氯霉素（2. 5yg/ml)的MRS平板，于30°C培养48h后筛选重 组子。
[0041] 3、制备植物乳杆菌的感受态细胞
[0042] 用MRSS(MRS，0. 3M蔗糖，1%甘氨酸）培养基培养植物乳杆菌BM-1，生长至0D600 =0? 4 ?0? 6，取 10ml菌液，于 6000rpm，4°C离心 8min，收集菌体；加入 2mlWashing buffer(0.3M鹿糖，ImMMgC12)重悬 2 次，6000rpm，4°C离心 8min，弃去上清；加入 2ml30% PEG-1500 重悬菌体，6000rpm，4°C离心lOmin，弃去上清，用 200y1 30%PEG-1500 重悬， 40y1分装备用。
[0043] 4、重组质粒电转化植物乳杆菌
[0044] 取植物乳杆菌BM-1感受态细胞40y1，与2y1重组质粒pll8148-ColV混合，转 移至2mm电转杯中，使用Bio-RadGenePulserXcell?型电转化仪，电转化条件为：1.5kv/ cm，9ms。电击后加入lml复苏培养基（MRS，0. 3M蔗糖，0. 1MMgCl2)于37°C培养2h，取适量 菌液涂布于含有氯霉素（5yg/ml)的MRS平板，于37°C培养48h后筛选重组子。同时电转 化pi18148,作为对照组。
[0045] 实施例3本发明的重组植物乳杆菌产大肠杆菌素V的活性检测方法
[0046] 将实施例2制得的重组植物乳杆菌和对照组菌株（电转化P118148得到的菌株） 在MRS液体培养基中培养至48h，6000rpm，4 °C离心，取上清液。调上清液pH至7. 0后， 利用TCA法对上清液进行浓缩，浓缩至100倍。使用大肠杆菌DH5a和单增李斯特氏菌 (ATCC54003)为指示菌，将指示菌培养至对数期早期，取100y1加入到10ml加热融化后冷 却至55°C左右的固体培养基中（李斯特氏菌为TYPE培养基；大肠杆菌为LB培养基），混合 均匀后倾倒入平板中，待冷却凝固后在培养基上放上牛津杯。向牛津杯中加入浓缩后的重 组菌株和对照组菌株的上清100y1，在4°C条件下静置过夜，然后放入37°C温箱培养，观察 抑菌圈的形成。结果表明转入空载体的对照组对DH5a没有抑制作用，而重组菌株上清对 DH5a有抑制作用（图2)，抑菌结果表明大肠杆菌素V在植物乳杆菌中成功进行表达。同 时重组菌株上清和对照菌株上清对单增李斯特氏菌均有相似抑制作用，表明大肠杆菌素V 的表达没有影响该菌株片球菌素PA-1的表达（图3)。
[0047] 本发明最初从抗菌肽的数据库中挑选出了 5个抗菌肽，分别为pBD-1、 Prophenin-l、PMAP_23、PorcineNK_Lysin、colicinV(大肠杆菌素V)。从GenBank中获得 以上抗菌肽的序列，经过密码子优化和片球菌素PA-1导肽序列融合，设计酶切位点，交由 公司合成。其余实验步骤均和上述方法一样。最后经过抑菌试验的验证，只有colicinV成 功分泌。因为抗菌肽的蛋白结构会影响其在分泌过程中是否能够被转运蛋白运输到胞外。
[0048] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种重组载体，其特征在于，携带有片球菌素导肽基因和成熟大肠杆菌素V基因连 接而成的融合基因。
2. 根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
3. 制备权利要求1或2所述重组载体的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将片球菌素导肽基因和编码大肠杆菌素V成熟蛋白的基因连接，合成融合基因，两 端添加酶切位点，构建在载体上； (2) 分别双酶切表达载体和步骤（1)获得的携带合成基因的载体，酶切后，将二者连 接； ⑶连接产物电转化感受态细胞，提取质粒，得到测序正确的质粒。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述片球菌素导肽基因的序列如 SEQ ID NO. 2所示；大肠杆菌素V成熟蛋白的基因序列如SEQ ID NO. 3所示；合成的融合基 因的序列如SEQ ID NO. 1所示；融合基因两端添加的酶切位点为Nco I和Eco R I，载体为 pUCK。
5. 根据权利要求3?4任一所述的方法，其特征在于，步骤（3)的感受态细胞为乳酸乳 球菌NZ9000的感受态细胞。
6. 含有权利要求1?2任一项所述的重组载体的宿主细胞。
7. -种分泌大肠杆菌素V的重组植物乳杆菌，其特征在于，含有权利要求1?2任一项 所述的重组载体。
8. 如权利要求7所述的重组植物乳杆菌，其特征在于，通过以下步骤制备得到： (1) 获得携带有片球菌素导肽基因和成熟大肠杆菌素V基因连接而成的融合基因的重 组载体； (2) 将步骤（1)的重组载体电转化入植物乳杆菌BM-1中。
9. 权利要求1?2任一项所述的重组载体或权利要求8?9任一所述的重组植物乳杆 菌在制备微生态制剂中的应用。
10. 含有权利要求8?9任一所述的重组植物乳杆菌在食品工业中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种分泌大肠杆菌素V的重组植物乳杆菌及其制备方法，属于微生物分子生物学领域，本发明的重组植物乳杆菌携带含有片球菌素导肽基因和成熟大肠杆菌素V融合基因的游离型表达载体。该重组植物乳杆菌是通过将片球菌素PA-1导肽和大肠杆菌素V成熟肽的融合基因连入表达载体，电转化的方法将连接产物转入乳酸乳球菌，提取重组质粒，再电转入植物乳杆菌BM-1中得到。本发明的重组植物乳杆菌能同时分泌片球菌素PA-1和大肠杆菌素V，对大肠杆菌属和单增李斯特氏菌属致病菌均具有很好的抑制作用，动物食用后不会产生毒副作用和残留，对环境和食品安全没有威胁，在饲料工业和食品工业领域具有良好的应用前景。
【IPC分类】C12R1-25, A23L3-3571, C12N1-21, C12N15-74, C12N15-31, A23K1-17, C12N15-66, A23K1-18
【公开号】CN104593404
【申请号】CN201410856189
【发明人】郝彦玲, 马夏吟
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月31日