X、3X、4X或5X -般应用水平。这 些耐性水平的提高在本发明的范围之内。例如可对本领域已知的多种技术进行可预见到的 优化和进一步发展，以增加给定基因的表达。
[0082] 本发明中，所述除草剂抗性蛋白质为24DT21氨基酸序列，如序列表中SEQ ID NO:2 所示。所述除草剂抗性基因为24DT21核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO: 1所示。所述除 草剂抗性基因为用于植物，除了包含由24DT21核苷酸序列编码的蛋白质的编码区外，也可 包含其他元件，例如编码转运肽的编码区、编码选择性标记的蛋白质或赋予昆虫抗性的蛋 白质的编码区。
[0083] 本发明中24DT21除草剂抗性蛋白质对大多数苯氧基生长素除草剂具有耐性。本 发明中的植物，在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含24DT21核苷酸序列，通过表 达有效量的该蛋白而保护其免受除草剂的威胁。有效量是指未损伤的或轻微损伤的剂量。 同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。
[0084] 植物材料中除草剂抗性蛋白质的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进 行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码除草剂抗性蛋白质的mRNA进行定量， 或直接特异性检测产生的除草剂抗性蛋白质的量。
[0085] 本发明提供了一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，具有以下优点：
[0086] 1、对除草剂抗性强。本发明除草剂抗性蛋白质24DT21对除草剂的抗性强，尤其是 针对苯氧基生长素除草剂，特别是2, 4-D。
[0087] 2、对除草剂抗性广。本发明除草剂抗性蛋白质24DT21蛋白可以对多种苯氧基植 物生长素除草剂表现出较高的抗性，因此在植物上应用前景广阔。
[0088] 下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
【附图说明】
[0089] 图1为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有24DT21核苷酸序列的 重组克隆载体DBNOl-T构建流程图；
[0090] 图2为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有24DT21核苷酸序列的 重组表达载体DBN100300构建流程图；
[0091] 图3为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有对照序列的重组表达 载体DBN100300N构建流程图；
[0092] 图4为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的转基因拟南芥1\植株除草 剂抗性效果图；
[0093] 图5为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的转基因大豆T1植株除草剂 抗性效果图；
[0094] 图6为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有24DT21核苷酸序列的 重组表达载体DBN100763构建流程图；
[0095] 图7为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有对照序列的重组表达 载体DBN100763N构建流程图。
【具体实施方式】
[0096] 下面通过具体实施例进一步说明本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的 技术方案。
[0097] 第一实施例、24DT21基因序列的获得和合成
[0098] 1、获得24DT21基因序列
[0099] 24DT21除草剂抗性蛋白质的氨基酸序列（292个氨基酸），如序列表中SEQ ID NO:2所示；依据植物偏好性密码子获得编码相应于所述24DT21除草剂抗性蛋白质的氨基 酸序列（292个氨基酸）的核苷酸序列（879个核苷酸），如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0100] 2、合成上述24DT21核苷酸序列
[0101] 所述24DT21核苷酸序列（如序列表中SEQ ID NO: 1所示）由南京金斯瑞生物科 技有限公司合成；合成的所述24DT21核苷酸序列（SEQ ID NO: 1)的5'端还连接有SpeI酶 切位点，所述24DT21核苷酸序列（SEQ ID NO: 1)的3'端还连接有KasI酶切位点。
[0102] 第二实施例、拟南芥和大豆重组表达载体的构建
[0103] 1、构建含有24DT21核苷酸序列的重组克隆载体DBNOl-T
[0104] 将合成的24DT21核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT : A3600)上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体 DBN01-T，其构建流程如图1所示（其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；Π 表示噬菌体Π 的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启 动子；24DT21为24DT21核苷酸序列（SEQ ID NO: I) ;MCS为多克隆位点）。
[0105] 然后将重组克隆载体DBN01-T用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞 (Transgen，Bei jing，China，CAT :CD501)，其热激条件为：50 μ L 大肠杆菌 Tl 感受态 细胞、10以1^质粒0嫩（重组克隆载体08冊1-1')，42°0水浴30秒；37°0振荡培养1小 时（IOOrpm转速下摇床摇动），在表面涂有IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）和 X-gal (5-溴-4-氯-3-卩引噪-β -D-半乳糖苷）的氨节青霉素（100mg/L)的LB平板（胰 蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7. 5)上生长过 夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨 苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7. 5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒： 将菌液在12000rpm转速下离心lmin，去上清液，沉淀菌体用100 μ L冰预冷的溶液I (25mM 1'1^-!1(：1，101111^0了4(乙二胺四乙酸），501111葡萄糖，？!18.0)悬浮；加入20(^1^新配制的溶 液II (0. 2M NaOH，1 % SDS (十二烷基硫酸钠）），将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min ;加 入150 μ L冰冷的溶液III (3M醋酸钾，5M醋酸），立即充分混匀，冰上放置5-10min ;于温度 4°C、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置 5111；[11 ;于温度4<€、转速12000印1]1条件下离心5111；[11，弃上清液，沉淀用浓度（￥/'\0为70%的 乙醇洗涤后晾干；加入30μL含RNase(20μg/mL)的TE(10mMTris-HCl，lmMEDTA，pH8·0) 溶解沉淀；于温度37°C下水浴30min，消化RNA ;于温度-20°C保存备用。
[0106] 提取的质粒经SpeI和KasI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组 克隆载体DBNOl-T中插入的所述24DT21核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷 酸序列，即24DT21核苷酸序列正确插入。
[0107] 2、构建含有24DT21核苷酸序列的拟南芥和大豆重组表达载体DBN100300
[0108] 用限制性内切酶SpeI和KasI分别酶切重组克隆载体DBNOl-T和表达载体 DBNBC-Ol (载体骨架：pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供）），将切下的24DT21核苷酸序列 片段插到表达载体DBNBC-Ol的SpeI和KasI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是 本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100300,其构建流程如图2所示（Kan : 卡那霉素基因 ；RB :右边界；AtUbilO :拟南芥Ubiquitin(泛素）10基因启动子（SEQ ID N0:3) ;24DT21 :24DT21核苷酸序列（SEQ ID N0:1) ;Nos :胭脂碱合成酶基因的终止子（SEQ ID N0:4) ;prCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S启动子（SEQ ID N0:5) ;PAT:草丁膦乙酰转移酶 基因 （SEQ ID N0:6) ;tCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S终止子（SEQ ID N0:7) ;LB:左边界）。
[0109] 将重组表达载体DBN100300用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞，其热激条 件为：50 μ L大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ L质粒DNA(重组表达载体DBN100300)，42°C 水浴30秒；37°C振荡培养1小时（IOOrpm转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素 (Kanamycin)的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L， 用NaOH调pH至7. 5)上于温度37°C条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基 (胰蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7. 5) 中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶SpeI和 KasI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100300在SpeI 和KasI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列，即24DT21核苷酸 序列。
[0110] 3、构建含有对照序列的拟南芥和大豆重组表达载体DBN100300N
[0111] 按照本发明第二实施例中1所述的构建含有24DT21核苷酸序列的重组克隆载 体DBN01-T的方法，利用对照序列（SEQ ID N0:8)构建含有对照序列的重组克隆载体 DBN01R-T。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01R-T中插入的对照序列 为序列表中SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，即对照序列正确插入。
[0112] 按照本发明第二实施例中2所述的构建含有24DT21核苷酸序列的重组表达载体 DBN100300的方法，利用对照序列构建含有对照序列的重组表达载体DBN100300N，其载体 结构如图3所示（载体骨架：pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供）；Kan :卡那霉素基因； RB:右边界；AtUbilO:拟南芥Ubiquitin (泛素）10基因启动子（SEQ ID NO: 3) ;mN:对照序 列（SEQ ID N0:8) ;Nos :胭脂碱合成酶基因的终止子（SEQ ID N0:4) ;prCaMV35S :花椰菜花 叶病毒35S启动子（SEQ ID N0:5) ;PAT:草丁膦乙酰转移酶基因 （SEQ ID N0:6) ;tCaMV35S: 花椰菜花叶病毒35S终止子（SEQ ID NO: 7) ;LB:左边界）。对阳性克隆进行测序验证，结果 表明重组表达载体DBN100300N中插入的对照序列为序列表中SEQ ID N0:8所示的核苷酸 序列，即对照序列正确插入。
[0113] 第三实施例、转入24DT21核苷酸序列的拟南芥植株的获得