I、重组表达载体转化农杆菌
[0115] 对己经构建正确的重组表达载体DBN100301和DBN100301N(对照序列）用液氮法 转化到农杆菌GV3101中，其转化条件为：100 μ L农杆菌GV3101、3 μ L质粒DNA (重组表达载 体）；置于液氮中10分钟，37°C温水浴10分钟；将转化后的农杆菌GV3101接种于LB试管 中于温度28°C、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平（Rifampicin) 和50mg/L的卡那霉素的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒， 用限制性内切酶SmaI和PstI酶切DBN100301后进行酶切验证，用限制性内切酶SmaI和 BglI酶切DBN100301N(对照序列）后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN100301和 DBN100301N(对照序列）结构完全正确。
[0116] 2、获得转基因拟南芥植株
[0117] 将野生型拟南芥种子悬浮于0. 1% (w/v)琼脂糖溶液中。将悬浮的种子在4°C下 保存2天以完成对休眠的需要以保证种子同步萌发。用蛭石混合马粪土并用水地下灌溉至 湿润，使土壤混合物排水24小时。将预处理后的种子种在土壤混合物上并用保湿罩覆盖7 天。使种子萌发并在恒温（22°C )恒湿（40-50% )光强度为120-150 ymol/m2秒的长日照 条件（16小时光照/8小时黑暗）下在温室中培养植物。开始用霍格兰营养液灌溉植物，接 着用去离子水灌溉，保持土壤潮湿但不湿透。
[0118] 使用花浸泡法转化拟南芥。用选取的农杆菌菌落接种一份或多份15-30mL含卡那 霉素（50mg/L)和利福平（10mg/L)的YEP培养液的预培养物。以220rpm将培养物在28°C 恒速摇动孵育过夜。每个预培养物用于接种两份500mL含卡那霉素（50mg/L)和利福平 (10mg/L)的YEP培养液的培养物并将培养物在28°C持续摇动孵育过夜。室温以约8700 X g 离心10分钟沉淀细胞，弃去得到的上清液。将细胞沉淀轻柔重悬于500mL渗透培养基中，所 述渗透培养基含有1/2XMS盐/B5维生素、10% (w/v)蔗糖、0.044μΜ苄氨基嘌呤（IOyL/ L(lmg/mL DMSO中的原液））和300 yL/L Silvet L-77。将约1月龄的植物在培养基中浸 泡15秒，确保浸没最新的花序。接着将植物侧面放倒并覆盖（透明或不透明）24小时，接 着用水洗涤并竖直放置。在22°C以16小时光照/8小时黑暗的光周期培养植物。浸泡约4 周后收获种子。
[0119] 将新收获的（24DT22核苷酸序列和对照序列）1\种子在室温干燥7天。将种子种 在26. 5 X 51cm萌发盘中，每盘接受ZOOmgT1种子（约10000个种子），所述种子事先已悬浮 于40mL 0. 1% (w/v)琼脂糖溶液并在4°C下保存2天以完成对休眠的需要以保证种子同步 萌发。
[0120] 用蛭石混合马粪土并用水地下灌溉至湿润，利用重力排水。用移液管将预处理后 的种子（每个40mL)均匀地种在土壤混合物上，并用保湿罩覆盖4-5天。在使用出苗后喷 洒草铵膦（选择共转化的PAT基因）进行最初转化体选择前1天移去罩。
[0121] 在7个种植天数后（DAP)并于IlDAP再次使用DeVilbiss压缩空气喷嘴以IOmL/ 盘（703L/ha)的喷洒体积用Liberty除草剂（200g ai/L的草铵膦）的0. 2%溶液喷洒1\植 物（分别为子叶期和2-4叶期），以提供每次应用280g ai/ha有效量的草铵膦。在最后喷洒 后4-7天鉴定存活株（生长活跃的植物），并分别移植到用马粪土和蛭石制备的7cm X7cm的 方盆中（每盘3-5棵）。用保湿罩覆盖移植的植物3-4天，并如前置于22°C培养室中或直接 移入温室。接着移去罩并在测试24DT22基因提供苯氧基生长素除草剂抗性的能力之前至 少1天将植物栽种到温室（22±5°C，50±30% RH，14小时光照：10小时黑暗，最小500 μ E/ Hl2S1天然+补充光）。
[0122] 第四实施例、转基因拟南芥植株的除草剂抗性效果检测
[0123] 用24DT22基因进行首次拟南芥转化。首先使用草铵膦选择方案从未转化种子背 景中选择T 1转化体。筛选了约20000个T ^中子中并鉴定了 314株T1代阳性转化子（PAT基 因），约1. 6 %的转化效率。将转入24DT22核苷酸序列的拟南芥T1植株、转入对照序列的 拟南芥T1植株和野生型拟南芥植株（播种后18天）分别对2, 4-D二甲铵盐和二甲四氯进 行除草剂抗性效果检测。
[0124] 分别将转入24DT22核苷酸序列的拟南芥T1植株、转入对照序列的拟南芥T i植株 和野生型拟南芥植株分别用2, 4-D二甲铵盐（560g ae/ha，1倍大田浓度）、二甲四氯（560g ae/ha，1倍大田浓度）和空白溶剂（水）喷洒。喷施7天和14天后统计植株抗性情况：7 天后生长状况和空白溶剂（水）一致的划为高抗植株，7天后有莲座叶卷曲的划为中抗植 株，14天后仍不能抽苔的划为低抗植株，14天后死亡的划为不抗植株。由于每株拟南芥T 1 植株是独立的转化事件，可以预计在给定剂量内个体!\应答的显著差异。结果如表1和图 4所示。
[0125] 表1、转基因拟南芥T1植株除草剂抗性实验结果
[0126]
【主权项】
1. 一种除草剂抗性蛋白质，其特征在于，包括： (a) 具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或 (b) 在（a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有 芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的由（a)衍生的蛋白质。
2. -种除草剂抗性基因，其特征在于，包括： (a) 编码权利要求1所述除草剂抗性蛋白质的核苷酸序列；或 (b) 在严格条件下与（a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶 活性的蛋白质的核苷酸序列；或 (c) 具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
3. -种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求2所述除 草剂抗性基因。
4. 一种包含权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒的重组载体。
5. -种产生除草剂抗性蛋白质的方法，其特征在于，包括： 获得包含权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒的转基因宿主生物 的细胞； 在允许产生除草剂抗性蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞； 回收所述除草剂抗性蛋白质。
6. 根据权利要求5所述产生除草剂抗性蛋白质的方法，其特征在于，所述转基因宿主 生物包括植物、动物、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。
7. 根据权利要求6所述产生除草剂抗性蛋白质的方法，其特征在于，所述植物为大豆、 棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。
8. -种增加耐受除草剂范围的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述除草剂抗性 蛋白质或权利要求3所述表达盒编码的除草剂抗性蛋白质在植物中与至少一种不同于权 利要求1所述除草剂抗性蛋白质或权利要求3所述表达盒编码的除草剂抗性蛋白质的第二 种核苷酸一起表达。
9. 根据权利要求8所述增加耐受除草剂范围的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸 编码草甘膦抗性蛋白质、草铵膦抗性蛋白质、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶、细 胞色素类蛋白质或原卟啉原氧化酶。
10. -种选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，包括：用权利要求2所述除草剂抗 性基因或权利要求3所述表达盒转化多个植物细胞，并在允许表达所述除草剂抗性基因或 所述表达盒的转化细胞生长，而杀死未转化细胞或抑制未转化细胞生长的除草剂浓度下培 养所述细胞，所述除草剂为苯氧基生长素。
11. 一种控制杂草的方法，其特征在于，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草 剂，所述作物包含权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒或权利要求4 所述重组载体。
12. 根据权利要求11所述控制杂草的方法，其特征在于，所述除草剂为苯氧基生长素。
13. -种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括：将权利要 求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒或权利要求4所述重组载体导入植物， 使导入后的植物产生足够保护其免受除草剂损害量的除草剂抗性蛋白质。
14. 根据权利要求13所述用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在 于，所述除草剂为苯氧基生长素。
15. 根据权利要求13或14所述用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征 在于，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。
16. -种控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性杂草的方法，其特征在于，包括：对 种植草甘膦耐性植物的大田施用有效剂量的除草剂，所述草甘膦耐性植物包含权利要求2 所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒或权利要求4所述重组载体。
17. 根据权利要求16所述控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性杂草的方法，其特 征在于，所述除草剂为苯氧基生长素。
18. 根据权利要求16或17所述控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性杂草的方法， 其特征在于，所述草甘膦耐性植物为单子叶植物或双子叶植物。
19. 一种赋予作物2, 4-D除草剂抗性的方法，其特征在于，包括：将权利要求2所述除 草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒或权利要求4所述重组载体导入植物。
20. 根据权利要求19所述赋予作物2, 4-D除草剂抗性的方法，其特征在于，所述植物为 大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。
21. -种除草剂抗性蛋白质耐受苯氧基生长素类除草剂的用途，其特征在于，所述除草 剂抗性蛋白质包括： (a) 具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或 (b) 在（a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有 芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的由（a)衍生的蛋白质。
【专利摘要】本发明涉及一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，除草剂抗性蛋白质包括：(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有除草剂抗性活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明除草剂抗性蛋白质特别适合在植物中表达，对除草剂抗性广，尤其苯氧基生长素除草剂。
【IPC分类】A01H5-00, C12N9-02, C12N5-10, C12N15-53, A01G7-06, C12N15-84
【公开号】CN104611308
【申请号】CN201510078810
【发明人】陶青, 吴业春, 牛晓广, 谢香庭, 庞洁, 鲍晓明
【申请人】北京大北农科技集团股份有限公司, 北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月13日