:莖；C-D :果荚；E :叶片；F :表皮毛；G :花；H :心皮与雄蕊；
[0036]图3是qRT-PCR与RNA原位杂交分析GhLTPGl基因的表达模式；
[0037] 其中，A :GhLTPGl在棉花不同组织及胚珠不同时期的定量检测结果；B:在纤维伸 长发育阶段，胚珠中GhLTPGl在徐州142及其突变体间的表达差异；C-D :反义探针杂3DPA 野生型胚珠；E-F :反义探针杂3DPA无絮突变体胚珠；G-H :正义探针杂3DPA野生型胚珠；D， F，G为放大的视野；f :纤维；isc :内表皮层；osc :外表皮层；C，E，G为放大100倍视野，D， F，G为放大200倍视野。
【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0039]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0040] 实施例1种皮与纤维组织特异启动子SFS的克降
[0041] (一）陆地棉（Gossypium hirsutum) DNA提取
[0042] 1)取新鲜棉花叶片加入有500 y L的CTAB缓冲液的离心管中（65°C预热），加入钢 珠，用样品快速研磨仪55Hz处理100秒直至叶片彻底打碎，65°C水浴锅水浴30分钟。
[0043] 2)加入5M KAc溶液150 y L，冰上20分钟；
[0044] 3)取出样品，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1)，温和颠倒混匀10分钟；4°C， 12000rpm离心10分钟；
[0045] 4)转移上清至新离心管中，加入2/3倍体积的异丙醇（-20°C );室温放置30分钟， 12000rpm离心2分钟，弃上清；
[0046] 5)加入75 %乙醇溶液500 y L，漂洗沉淀一小时；重复漂洗三次；
[0047] 6)加入75 %乙醇溶液500 y L，室温过夜沉淀DNA;
[0048] 7) 12000rpm离心2分钟，弃上清，将沉淀溶于30~50 y L水中，-20°C储存备用。
[0049](二）SFS启动子序列克隆
[0050] 以棉花基因组DNA为模板，先用外侧引物进行第一轮扩增，所述外侧引物如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示：
[0051] SEQ ID NO. 2：TAGAGAGCGTCAAAGGCTAAATACAAAT,
[0052] SEQ ID NO. 3 ：TTGCTGCACTCATTCGCTAACC；
[0053]然后以稀释50倍的第一轮PCR产物为模板，用内侧引物进行第二轮扩增，所述外 侧引物如SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5所示：
[0054] SEQ ID NO. 4 ：ACGCG TCGAC CAGTT TGCCG CCTGC CGTTC,
[0055] SEQ ID NO. 5 ：CTCAT GCCAT GGCCC CTAAA CTATT GAAGC AAAT；
[0056] 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条约930bp的启动子序列。回收后 连接PMD18-T载体，送交生物公司测序检测。该序列即为SFS启动子，序列见SEQ N0:1。
[0057]实施例2 :SFS启动子棺物表汰裁体构律
[0058]选实施例1中测序正确的菌株提取质粒，用于植物表达载体的构建。将上述含有 目的基因的重组载体质粒与空的PCAMBIA1305质粒分别进行SacI和Ncol双酶切。37°C 酶切15~30分钟，对酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收重组质粒酶切后的 SFS启动子片段和pCAMBIA1305酶切后的载体大片段并连接，连接体系如下：
[0059]
【主权项】
1. 一种核苷酸SFS，其特征在于，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -组用于扩增根据权利要求1所述核苷酸SFS的外侧引物对，其特征在于，所述外侧 引物对的序列如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。
3. -组用于扩增根据权利要求1所述核苷酸SFS的内侧引物对，其特征在于，所述内侧 引物对的序列如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5所示。
4. 一种重组载体，其特征在于，包含根据权利要求1所述的核苷酸SFS。
5. -种转化体，其特征在于，包含根据权利要求1所述的核苷酸SFS。
6. -种根据权利要求1所述的核苷酸SFS作为启动子的用途。
7. -种根据权利要求1所述的核苷酸SFS的制备方法，其特征在于，包括人工合成法或 生物克隆法。
8. 根据权利要求7所述的核苷酸SFS的制备方法，其特征在于，所述人工合成的方法具 体为： 步骤一、根据核苷酸SFS的正链和副链序列，分别合成出长度150~200bp、具有粘性末 端的单链寡核苷酸正链片段和单链寡核苷酸副链片段； 步骤二、将所述单链寡核苷酸正链片段和单链寡核苷酸副链片段分别退火，形成带有 粘性末端的双链寡核苷酸片段； 步骤三、混合所述双链寡核苷酸片段，经T4DNA连接酶催化组装成一个完整的核苷酸 SFS0
9. 根据权利要求7所述的核苷酸SFS的制备方法，其特征在于，所述生物克隆法具体 为： 步骤1、提取棉花DNA ; 步骤2、以所述DNA为模板，依次用权利要求2所述的外侧引物、权利要求3所述的内侧 引物进行扩增； 步骤3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，即得核苷酸SFS。
【专利摘要】本发明属于植物基因工程领域，公开了一种种皮与纤维组织特异性表达启动子SFS及其应用，所述启动子SFS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的SFS启动子具有如下特性：A、在棉花和拟南芥组织的表达情况十分明确，该启动子在棉花等植物上没有报道；B、结构新，在核酸水平上与已见报道的其它启动子无任何同源性，同源性位点不含有现有专利保护序列和突变位点。
【IPC分类】C12N15-82, C12N15-11, C12N15-10, C12N15-113, C12N1-21
【公开号】CN104651367
【申请号】CN201510073571
【发明人】左开井, 邓婷, 韩慧超, 王俊
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月11日