延 伸技术在引物末端标记荧光素，观察标记物的荧光偏振量来了解待测DNA的目标CpG位点 的甲基化状态。
[0031] 本发明所提供的DNA甲基化检测方法采用测定标记物的荧光偏振量来确定目标 CpG的甲基化状态，克服了现有DNA甲基化检测技术诸如电泳分析中需要分离、纯化，操作 复杂的不足，具有简便、快捷、高通量、低成本、无需分离纯化等优点，适合大量检测临床珍 贵的低浓度DNA样本的甲基化。
【附图说明】
[0032]图1、检测DNA甲基化流程图。
[0033] 图2、实施例1所用检测DNA目标CpG序列。
[0034] 图3、用引物3用于检测不同质量基因组DNA中CpGl的甲基化。
[0035] 图4、用引物4用于检测不同质量基因组DNA中CpG2的甲基化。
[0036] 图5、用引物5用于检测不同质量基因组DNA中CpG3的甲基化。
[0037] 图6、用引物3用于检测CpGl甲基化为25%的不同量质粒DNA的结果。
[0038] 图 7、用引物 3 用于检测 CpGl 甲基化为 0%、20%、25%、40%、60%、80%、100%的 质粒DNA的结果。
[0039] 图8、应用酶切/电泳分离（COBRA)方法检测CpGl甲基化为0%、20%、25%、40%、 60%、80%、100%的质粒0嫩的结果。
[0040] 图9、引物3用于检测DNA甲基化抑制剂AZA诱导肿瘤细胞低DNA甲基化的结果。
[0041] 图10、引物3用于检测不同肿瘤细胞基因组DNA甲基化的结果。 具体实施例
[0042] 以下的实施例便于更好的理解本发明，但不限定于本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中以人类基因组中的LINE1元件（NCBI序 列号为X58075,具体序列如SEQ ID NO. 1所示，CpG结构见图2)为研宄对象，对其启动子区 部分CpG位点的甲基化进行检测。
[0043] 实施例1.在人类外周血基因组DNA甲基化检测的应用
[0044] 步骤（1)、外周血DNA的提取：
[0045] 按照传统苯酚/氯仿方法抽提外周血基因组DNA。
[0046]步骤（2)、亚硫酸氢钠处理：
[0047] 将1微克人类外周血DNA并用亚硫酸氢钠处理，使所述待测DNA中未甲基化的胞 嘧啶脱氨基变成尿嘧啶，放在-20 °C保存。
[0048] 所述的亚硫酸氢钠处理待测DNA的反应参数为：
[0049] (1) 1 y g待测DNA与0. 3M NaOH -起在42°C孵育20分钟，然后95°C孵育3分钟和 〇°C孵育1分钟；
[0050] (2)接下来同pH 5. 0的亚硫酸氢纳（终浓度5. 0M)和对苯二酚（终浓度0? 5mM) 在55°C孵育16小时，并保持避光；
[0051] (3)处理后DNA用PromegaWizardDNACleanSystem进行纯化，并溶解在 0? 3M 的NaOH中，37°C孵育15分钟后用3M的醋酸铵中和至pH7. 0 ;
[0052] (4)75%的乙醇沉淀中和产物，并溶解在20 yl TE中，保存在-20°C。
[0053] 步骤（3)、PCR 扩增：
[0054] 引物 1 序列：TITITTGAGTTAGGTGTGTGGG(SEQIDNO. 2)
[0055] 引物 2 序列：CATCTCTAAAAAATACCAAACAA(SEQIDNO. 3)
[0056] PCR反应条件：15微升反应体系包含：75nM的引物1和引物2,50nM的dNTPs，lX PCR缓冲液，和1个单位的Taq DNA聚合酶；混合物置于95°C反应1分钟后，进行以下30个 循环：95°C加热1分钟，60°C加热1分钟，72°C加热1分钟。
[0057] 步骤（4)，对PCR产物进行酶切消化处理以去除未反应的引物和dNTPs。酶切体系 中含：3. 75 y 1 10X碱性磷酸酶反应缓冲液，3. 4单位碱性磷酸酶，2. 3单位核酸外切酶和 13yl PCR产物，用去离子水补至37.5yl。将混合物置于37°C反应45分钟，再于85°C加 热15分钟使酶失活。
[0058] 步骤（5)，单碱基延伸标记反应检测序列中的CpGl位点甲基化。延伸标记反应总 体积15 y 1，含1. 5 y 1酶消化过的PCR产物，0. 75单位Tag聚合酶，1XPCR Buffer，3. 75 y M 第三引物，1. 125yM荧光素dCTP或0. 5625 yM荧光素dUTP。反应条件：95°C变性3分钟 后，进行以下30个循环：95°C温育30秒，55°C温育30秒。
[0059] 引物 3 序列：GGTGGGAGTGAIT
[0060] 步骤（6)，荧光偏振量测定：
[0061] 将延伸标记后的产物置于FP检测仪上直接测定其荧光偏振值，激发波长为 544nm，发射波长为595nm。
[0062] 结果分析：
[0063] 图3为来自同一样本，但检测时使用不同浓度的DNA。每一个DNA浓度点的FP值 减去零浓度空白点FP值后，按照如下公式估算待测位点甲基化水平：
[0064] 甲基化水平 ％ = 100XFPdCTPAFPdCTP+FPdUTP)
[0065] 从图3可以看出，20-100ng范围内，本发明利用第三引物对CpGl的甲基化水平检 测表现出很好的稳定性，其值为：57. 13±0. 26%
[0066] 图4是使用第四引物进行单碱基延伸（引物序列为GAAAGGGAATTTTTTGATTTTTTG， SEQ ID NO. 4)对CpG2位点甲基化的检测结果，该CpG位点甲基化水平为：67. 06± 1. 40%
[0067] 图5是使用第五引物进行单碱基延伸（引物序列为TTTTTTAGGTGAGGTAATGTTT，SEQ ID NO. 5)对CpG3位点甲基化的检测结果，该CpG位点甲基化水平为：84. 11 ± 1. 47%。
[0068] 实施例2,质粒DNA甲基化的检测应用
[0069] 1、本实施例中所用质粒的合成方法如下所述：
[0070] (1)将实施案例1步骤（3)的PCR产物通过TA克隆连接到PMD-18T载体上，通过 对转化子单克隆测序，筛选出CpG 1的序列为C的质粒A(完全甲基化模板）和CpGl的序 列为T的质粒B (完全去甲基化模板）。即：CpGl在质粒A中的甲基化水平为100 %，在质 粒B中的甲基化水平为0%。
[0071] (2)将质粒A和质粒B按照质量比进行混合，从而获得CpGl的(V (C+T) %分别为 0%、20%、25%、40%、60%、80%、100%的混合物。
[0072] 2、PCR扩增：
[0073] 同实施例1步骤（3)。
[0074] 3、单碱基延伸标记反应：
[0075] 同实施例1步骤（5)，利用第三引物进行单碱基延伸标记反应。
[0076] 4、荧光偏振量测定：
[0077] 同实施例1步骤（6)。
[0078] 5、结果分析：
[0079] 图6是对的CpGl位点为25%甲基化质粒DNA进行检测的结果。本发明对不同浓 度质粒DNA中CpG1的甲基化检测展示了很好的稳定性。
[0080] 图7对CpGl位点的甲基化程度是20 %、40 %、60 %、80 %的质粒DNA检测结果分别 为 25. 649±4. 521%，39. 83±3. 877%，53. 270±4. 823%，75. 747±2. 231%。检测结果与 实际有很尚的相关性。
[0081] 实施例3,酶切/DNA胶分离（COBRA)检测CpGl位点的甲基化
[0082] 本实施例中采用TaqI酶切，然后DNA胶分离，EB染色，拍照定量的方法对实施案 例二制作的CpGl位点甲基化程度为0%、20%、25%、40%、60%、80%、100%的质粒0嫩进 行检测。
[0083] 待测DNA经引物1和引物2PCR扩增产生的片段为250bp。片段内待测目标CpGl 的位点完全甲基化的序列为TCGA，经TaqI消化后产生163bp和87bp的两个片段（图8); 而该CpGl位点完全去甲基化的序列为TTGA，无法被TaqI消化。对消化产物163bp和87bp 的定量，则可以算出该CpGl位点的甲基化程度。
[0084] 2、PCR扩增：
[0085] 同实施例1步骤（3)，分别扩增实施案例一中的0%、20%、25%、40%、60%、80%、 10