所受的浮力，我们发现磁场强度需要在26mT之上，如果低 于这个值，无法保证载体在培养容器运动时固定在同一个位置。
[0018] 培养容器对调的过程时，由于惯性，细胞及载体会有一定的移动，为了控制最小的 移动，将载体固定在培养容器的一端，减少对细胞的挤压，并且可以避免在旋转或者翻转过 程的载体贴壁运动，减少对细胞的挤压。
[0019] 在我们对不同密度的载体研究中，使用过各种密度的载体，从0. 2-8g/cm3的载体， 用空心的塑料珠子添加不同重量的金属制作成不同密度的载体，在装有细胞的培养容器中 进行尝试，根据载体在培养液中的运动速度评价搅拌对细胞产生的剪切力大小，根据搅拌 后达到的均匀程度评价其搅拌的效率，在培养容器两端对调过程中观察载体是否会因为惯 性产生横向移动来评价载体的适合的密度。
[0020] 在一个实施例，生物反应器系统中使用磁场强度为70mT的永磁铁作为磁场发生 器，培养容器对调过程中，载体的运动长度为200_，使用密度小于培养基的载体时，在没有 外力的条件下载体能自由上升至培养容器的上部。载体加入培养容器，不完全铺满对调的 两端，在培养容器两端对调前，永磁铁移动至靠近培养容器的一端，对调后，磁铁远离，载体 迅速上升。培养容器两端对调前磁铁吸引住载体，需要保证能培养容器外的磁铁能牢固的 吸引住载体，载体密度为〇. 6g/cm3时，培养容器与载体的密度差比较大，在对调过程中会产 生微小的位移，随着密度的增大，载体更容易被磁铁吸引，在对调过程中不产生横向移动。 随着载体密度增加，与培养基的密度差逐渐减小，载体在容器中从一端上升至另一端的时 间变长，移动逐渐变得温和，但是在载体密度为lg/cm3时，载体与培养基的密度相同时，撤 去磁场载体在培养容器中几乎不移动。兼顾载体能吸附在培养容器上以及比较温和的移动 状态，在载体密度为〇. 6-0. 98g/cm3之间更合适。
[0021] 在一个实施例，生物反应器系统中使用磁场强度为70mT的永磁铁作为磁场发生 器，培养容器对调过程中，载体的运动长度为200_，将不同质量的金属填充到空心塑料载 体中，模拟不同密度的密度比培养基大的载体，培养容器两端对调前，先将磁场靠近培养容 器，将载体吸附在培养容器的底部，执行培养容器两端对调的程序，载体对调至培养容器的 顶端，将磁场远离，载体自由下落，在载体密度为lg/cm3时，与培养液密度相同，磁场远离 培养容器，载体不受磁场作用的时候，载体几乎不动，下落时间很长，随着密度增大，载体与 培养液的密度差变大，载体从一端移动到另一端的速度变快，载体运动对细胞的剪切力增 大，更易使细胞损伤。在培养容器两端对调过程时，磁场作用于载体时，需要载体牢固的吸 附在培养容器一端，载体与培养液的密度差增大时，对调时需要载体有更大的作用力，才 能保证载体不产生移动，实验中，看到在载体密度为1. 4g/cm3时，培养容器对调时，载体产 生细微的移动。兼顾载体能吸附在培养容器上以及比较温和的移动状态，在载体密度为 1. 02-1. 4g/cm3之间更合适。
[0022] 两种不同载体的运动方式的方案：
[0023] 1、使用密度小于培养基密度的细胞载体，一个动静交替的过程如图1所示，初始 时为细胞培养状态，如图l_a，培养容器的A端在下，B端在上；通过一定的外力将细胞载体 2固定在培养容器1底部（此时A端位于底部），在进行翻转周期时，见图1-b，先通过改变 作用在载体2上的外力（如关闭A端的磁场3)，使载体2由培养容器1的底部移至培养容 器1的顶部（此时B端位于顶部），打开培养容器B端的磁场4,使载体2固定在B端，如图 1-c，随后，培养容器两端位置对调，使A端在上，B端在下，载体2跟随着培养容器的两端位 置变化转至容器底部，如图1-d至1-e，改变作用在载体2的外力（如关闭B端的磁场4)， 如图1-f，重复图1-b至1-e的上述步骤，重复4-20次，使细胞均匀分布。
[0024] 2、使用密度大于培养基密度的细胞载体，一个动静交替的过程如图2所示，初始 时为细胞培养状态，如图2-a，培养容器的A端在下，B端在上；细胞载体2位于在培养容器 1底部（此时A端位于底部），改变作用在载体2上的外力（如打开A端的磁场3)，使载体2 固定在培养容器A端上，此时，进行培养容器1的A、B两端对调，使A端在上，B端在下，，由 于培养容器1的对调，载体2的相对位置变为容器顶端（此时A端位于顶端），如图2-b至 2-c，接着，关闭A端的磁场3,载体2向下移动，如图2-d，此时载体2又到达容器底部（此 时B端位于底端），如图2-e，打开B端的磁场4,进行培养容器1两端对调，见图2-f，重复 图2-b至2-e上述步骤，进行4-20次，使细胞在容器1中均匀分布。
[0025] 在我们在对细胞生长载体与成簇关系的研究中，清楚地显示，小体积载体引起粘 附细胞的聚集更早更严重。如下表1。
[0026] 表1:球粒规格对有贴壁细胞的载体结块的影响
【主权项】
1. 一种细胞培养的方法，其特征在于 A. 在同一个培养容器进行的细胞培养至少包括静态培养的过程、载体运动的过程、培 养容器两端对调的过程和细胞分布的过程； B. 培养容器中具有载体； C. 静态培养的过程中，载体分布于培养容器的一端，细胞分布在载体的表面、载体之间 的空隙或培养容器内的任何部分中，与培养容器保持相对静止； D. 载体运动的过程中，载体由培养容器的一端向另一端运动； E. 培养容器对调的过程中，载体固定在培养容器的一端，并随培养容器的两端位置变 化发生对调； F. 细胞分布的过程中，载体重新位于培养容器的一端，细胞由混悬状态分布在载体的 表面、载体之间的空隙或培养容器内的任何部分中。
2. 根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于载体先由培养容器的底端向顶端 运动，然后载体以相对于培养容器静止的方式，跟随培养容器的两端进行位置对调。
3. 根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于载体先以相对于培养容器静止的 方式，跟随培养容器的两端进行位置对调，然后载体由培养容器的顶端向底端运动。
4. 根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于载体的直径大于1mm。
5. 根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于载体的密度不超过8g/cm3。
6. 根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于细胞培养过程中所用的各载体的 质量、体积或密度不均一。
7. 根据权利要求5所述的细胞培养方法，其特征在于载体密度比培养基密度小 0? 02-0. 4g/cm3。
8. 根据权利要求5所述的细胞培养方法，其特征在于载体密度比培养基密度大 0? 02-0. 4g/cm3。
9. 根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于静态培养之间的动态培养由载体 运动和培养容器两端对调循环重复进行4-20次来实现。
10. 根据权利要求9所述的细胞培养方法，其特征在于每次两端对调之间的时间间隔 能确保载体从培养容器的底端移动到顶端或者顶端移动到底端。
11. 根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于所述的载体可磁化，在磁场下具 备磁性，在远离磁场下磁性快速消失；培养容器对调的过程中，载体在磁场的作用下固定在 培养容器的一端。
12. 根据权利要求11所述的细胞培养方法，其特征在于培养容器的两端完成1次对调 的时间T(s)与磁场强度B(mT)之间符合公式T彡IO5 ?B'
13. 根据权利要求11所述的细胞培养方法，其特征在于将载体固定在培养容器一端的 磁场强度不低于26mT。
14. 根据权利要求11所述的细胞培养方法，其特征在于细胞培养过程中载体分布于培 养容器中至少1层。
15. 根据权利要求11所述的细胞培养方法，其特征在于载体由培养容器的一端向另一 端运动，运动的速率不高于lm/s。
16. 根据权利要求11所述的细胞培养方法，其特征在于培养容器的两端完成1次对调 的时间T不低于0.5s。
17. 根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于培养容器的对调采用围绕轴翻 转的方式。
18. 根据权利要求17所述的细胞培养方法，其特征在于培养容器翻转的线速度v(mm/ s)与培养容器的长度L(mm)之间符合公式0. 03 ?L彡V彡10 ?L。
19. 根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于培养过程中的静态培养时，载体 位于培养容器的底端，培养容器为可旋转和/或翻转的结构，当培养容器的任意侧壁位于 下方时，该侧壁为培养器的底端。
20. 根据权利要求19所述的细胞培养方法，其特征在于细胞生长所位于的培养容器的 底部由培养容器的不同侧壁在培养过程中交替构成。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及一种新的细胞培养方法，适用于各种细胞，特别适用于对培养条件敏感的干细胞。本发明涉及一种动静态交替的细胞培养方法，在细胞培养过程中，在同一个培养容器进行的细胞培养至少包括静态培养的过程、载体运动的过程、培养容器两端对调的过程和细胞分布的过程。在同一细胞培养容器中构建了一种动静态交替培养的理想反应器，可以尽可能减小剪切力，避免细胞生长时聚集成团，在培养时使细胞均匀分布，并进一步避免载体在培养容器对调过程中产生横向移动，为细胞培养提供一个理想的生长代谢的环境。
【IPC分类】C12N5-02, C12N5-0789
【公开号】CN104694474
【申请号】CN201510149760
【发明人】张永新, 叶治家, 王珍应, 王珍祥, 徐张展, 王瑛, 夏静, 莫妮卡·张, 朱融晖, 谭玉麟, 戴青
【申请人】南京新诺丹生物技术有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月31日