一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵技术领域；具体涉及一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法。
【背景技术】
[0002]枯草芽孢杆菌是一种好氧细菌，也是一种重要的工业菌种，已经被广泛的应用于畜牧、医药、植物病害防治等领域，具有广泛的应用前景，显示出巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌微生态制剂绝大部分产品都是以活菌发挥作用的，有效的活菌数是衡量微生态制剂质量的重要指标，产品中必须含有相当数量的活菌数才能发挥作用。但是微生态制剂随着保存时间的延长，活菌数量不断减少，在一定时期内，其有效活菌数降低影响其使用效果。枯草芽孢杆菌因其独特的营养体一一芽孢，使其具有抵抗热、干燥、辐射、酸、碱等不良环境的生理特性，所以说芽孢的产生能延长其微生态制剂的保存期。然而，目前广泛应用的活菌制剂由于芽孢形成的不稳定，仍然普遍存在保存期短、活性不稳定等缺点，给实际应用带来很多困难。
[0003]在现阶段的工业化生产中，由于便于控制影响培养的各个因素，使液态培养成为工业发酵的主要培养手段。然而，在液态培养中枯草芽孢杆菌产生芽孢的工艺条件不易控制，芽孢形成率低下，与此同时，发酵过程中常存在着发酵周期长、活菌数低等问题。
【发明内容】
[0004]本发明解决在枯草芽孢杆菌的液体发酵过程中芽孢形成相关工艺条件不易控制、芽孢形成率低，且发酵周期长、活菌数低的问题，实现枯草芽孢杆菌高密度培养的同时获得95%以上的芽孢形成率；提供了一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法。
[0005]本发明中一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法是按下述步骤进行的:一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法是按下述步骤进行的:
[0006]步骤一、菌种的活化:挑取斜面的单菌落菌种接入试管种子培养基，在30°C条件下以70r/min速度震荡培养16h得到种子液，所述试管种子培养基按质量百分比的配方如下:0.8%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.3%氯化钠、0.2% K2HPO4,0.2% CaCO3、余量为水，初始pH值为 7.2-7.5 ；
[0007]步骤二、摇瓶种子培养:将种子培养基装入摇瓶中，然后按2%接种量接入步骤一获得的种子液，再在温度30°C、速度为180r/min条件下摇床培养16h，获得种子液，所述种子培养基配方与步骤一中所述的试管种子培养基相同；
[0008]步骤三、发酵:将发酵培养基置于发酵罐中，然后按1%接种量接入经步骤二获得的种子液，然后在温度为30°C、pH值为7、溶氧控制在70%以上(通气量一般控制在10-15L/min)、罐压0.01?0.03MPa和搅拌速度为250?400r/min条件下搅拌发酵；
[0009]步骤四、当发酵至菌体的残糖量为0.1% ( —般需要耗时20_24h)，开始加入补料液将残糖量控制在0.1?0.2之间(补料液的流加速度3mL/min)条件下发酵，补料5?7h后停止补料后继续发酵4h，然后调节pH值为8.5-9并将溶氧控制在90%以上，直至发酵结束(一般时间为3-5h)；
[0010]其中步骤三所述发酵培养基按质量百分比的配方如下:0.5%?1.0%葡萄糖、0.2%?0.8%酵母膏、0.1%?0.5%氯化钠、0.1%?0.4% K2HPO4^0.01%?0.05% MgSO4,0.01%?0.02% MnSO4、余量为水，初始pH值为7.2-7.5 ；
[0011]步骤四所述补料液按质量百分比的配方如下:葡萄糖8%?12%，酵母膏3%?5%，初始 pH 值为 7.2-7.5ο
[0012]本发明通过对枯草芽孢杆菌发酵工艺的严格控制，适时补充特定的补料液，来延长菌株的对数生长期，使其活菌数能达到90亿/mL ;通过对pH和溶氧的联合控制稳定的促进枯草芽孢杆菌芽孢的形成，形成率达到95%以上。
[0013]本发明实现枯草芽孢杆菌的高密度培养的同时提高芽孢形成率，延长其制剂保存期并增加其稳定活性，保存期在5年以上。
【具体实施方式】
[0014]本实施方式中采用保藏编号CGMCC N0.10603的枯草芽孢杆菌进行培养，具体方法如下:
[0015]步骤一、斜面种子的活化:挑取斜面的单菌落菌种接入试管种子培养基(5mL)，30°C震荡(70rpm)培养16h。试管种子培养基组成:葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，K2HP042g/L，CaC032g/L，初始 pH 为 7.2-7.5。
[0016]步骤二、种子的培养:摇瓶种子培养基装液量50/500mL，按2%接种量接入试管种子液，30°C摇床ISOrpm培养16h，得到种子液；摇瓶种子培养基同试管种子培养基。
[0017]步骤三、分批发酵:发酵培养基(葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，K2HP042g/L，MgSO40.2g/L，MnSO40.lg/L，初始 pH 为 7.2-7.5)装液量 10/20L，按 1%接种量接入摇瓶种子液，30°C，pH值7，通气量10-15L/min，罐压0.01-0.03MPa，搅拌50_600rpm发酵，溶氧控制在70%以上；
[0018]步骤四、发酵至菌体的对数生长中后期(残糖量为0.1%左右)6h，开始补料发酵，补料液(葡萄糖10%，酵母膏4%，初始pH 7.2-7.5)流加速度3mL/min，残糖量控制在
0.1-0.2之间，补料7h，停止补料继续发酵4h，然后调节pH值为8.5_9，提高溶氧到90%以上，直至发酵结束(3-5h)。
[0019]本实施方式枯草芽孢杆菌的活菌数能达到90亿/mL ;形成率达到95%以上。保存期5年以上，5年时活菌数能达到80亿/mL。
【主权项】
1.一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法，其特征在于一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法是按下述步骤进行的: 步骤一、菌种的活化:挑取斜面的单菌落菌种接入培养基中培养； 步骤二、摇瓶种子培养； 步骤三、发酵:将发酵培养基置于发酵罐中，然后按I %接种量接入经步骤二获得的种子液，然后在温度为30°C、pH值为7、溶氧控制在70%以上、罐压0.01?0.03MPa和搅拌速度为250?600r/min条件下搅拌发酵； 步骤四、当发酵至菌体的残糖量为0.1 %，开始加入补料液将残糖量控制在0.1?0.2之间条件下发酵，补料5?7h后停止补料后继续发酵4h，然后调节pH值为8.5-9并将溶氧控制在90%以上，直至发酵结束； 其中步骤三所述发酵培养基按质量百分比的配方如下:0.5%?1.0%葡萄糖、.0.2%?0.8%酵母膏、0.1%?0.5%氯化钠、0.1%?0.4% K2HPO4^0.01%?0.05% MgSO4,.0.01%?0.02% MnSO4、余量为水，初始pH值为7.2-7.5 ； 步骤四所述补料液按质量百分比的配方如下:葡萄糖8%?12%，酵母膏3%?5%，初始 pH 值为 7.2-7.5 ο2.根据权利要求1所述的一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法，其特征在于 步骤一中菌种的活化是按下述操作进行的:挑取斜面的单菌落菌种接入试管种子培养基，在30°C条件下以70r/min速度震荡培养16h得到种子液，所述试管种子培养基按质量百分比的配方如下:0.8%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.3%氯化钠、0.2% K2HPO4,0.2% CaCO3、余量为水，初始pH值为7.2-7.5 ο3.根据权利要求1所述的一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法，其特征在于步骤二中摇瓶种子培养是按下述操作进行的:将种子培养基装入摇瓶中，然后按2%接种量接入步骤一获得的种子液，再在温度30°C、速度为180r/min条件下摇床培养16h，获得种子液，所述种子培养基按质量百分比的配方如下:0.8%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.3%氯化钠、0.2% K2HP04、0.2% CaCO3、余量为水，初始 pH 值为 7.2-7.5。4.根据权利要求1所述的一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法，其特征在于步骤三发酵培养基按质量百分比的配方如下:0.8%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.3%氯化钠、0.2% Κ2ΗΡ04、0.02% MgS04、0.01 % MnS04、余量为水，初始 pH 值为 7.2-7.5。5.根据权利要求1所述的一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法，其特征在于步骤四所述补料液按质量百分比的配方如下:葡萄糖10%，酵母膏4%，初始pH值为.7.2-7.5。
【专利摘要】一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法，本发明要解决在枯草芽孢杆菌的液体发酵过程中芽孢形成相关工艺条件不易控制、芽孢形成率低，且发酵周期长、活菌数低的问题。方法如下：菌种的活化；然后摇瓶种子培养，然后发酵培养，当发酵至菌体的残糖量为0.1％，开始加入补料液将残糖量控制在0.1～0.2之间条件下发酵，补料5～7h后停止补料后继续发酵4h，然后调节pH值为8.5-9并将溶氧控制在90％以上，直至发酵结束。发酵培养基：葡萄糖、酵母膏、氯化钠、K2HPO4、MgSO4、MnSO4、余量为水，初始pH值为7.2-7.5；补料液按的配方：葡萄糖，酵母膏，初始pH值为7.2-7.5。本发明用于培养枯草芽孢杆菌。
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/125
【公开号】CN104894032
【申请号】CN201510345610
【发明人】孟利强, 赵晓宇, 张淑梅, 李晶, 曹旭, 胡基华, 陈镜宇
【申请人】黑龙江省科学院微生物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日