br>[0053] 下列实施例中如无特殊说明，均为《分子克隆实验指南（第三版）》（科学出版社， 2002年）所记载的方法。下列实施例中，引物DNA的合成和DNA测序委托上海生工生物工 程股份有限公司进行。化学试剂（Trizol、各种缓冲液、氯仿等）、分子生物学试剂盒和酶类 从杭州南天生物科技有限公司购买。所用玻璃、塑料制品、金属器材可用0. 1% DEPC水浸泡 过夜后消毒无菌，其中玻璃、金属器材也可用180°C干烤6小时，以去除被污染的RNA酶。
[0054] 实施例1转基因植物的制备
[0055] 为了证明本发明中检测方法在植物和基因方面的通用性，本实施例中以模式植物 拟南芥为转基因植物表达dsRNA，dsRNA基因为模式基因绿色荧光蛋白（GFP)基因，GFP序 列如SEQ ID No: 1所示。
[0056] 农杆菌转化T-DNA载体是基于pCambia 1300载体（Cambia公司）而构建，具体实 验步骤如下：
[0057] 1)获得可用于表达GFP dsRNA的DNA片段
[0058] GFP片段的核苷酸序列从pEGFP-Nl载体（Clontech公司）中扩增出，引物两端设 计酶切位点：
[0059] GFPSF-BamHl :5, GTGGGATCC atgagtaaaggagaagaact，5' 端被设计上 BamHI 位点
[0060] GFPSR-EcoRl :5'GTGGAATTC tttgtatagttcatccatgc，5' 端被设计上 EcoRI 位点
[0061] GFPSF-Sacl :5, GTGGAGCTC atgagtaaaggagaagaact，5' 端被设计上 SacI 位点
[0062] GFPSR2-EcoRl :5' GTGGAATTC gccattctttggtttgtctc，5' 端被设计上 EcoRI 位点
[0063] 将GFPSF-BamHl和GFPSR-EcoRl为一对引物，以pEGFP-Nl载体为模板进行扩增， 对PCR产物进行纯化获得DNA片段，再进行BamHl/EcoRl酶切并纯化获得纯化后的DNA片 段，命名为GFP-sense。
[0064] 将GFPSF-Sacl和GFPSR2-EcoRl为一对引物，以pEGFP-Nl载体为模板进行扩增， 对PCR产物进行纯化获得DNA片段，再进行Sacl/EcoRl酶切并纯化获得纯化后的DNA片段， 命名为 GFP-anti-sense。
[0065] 将pUCmT载体（购于上海生物工程有限公司）以BamHl和Sacl进行酶切并纯化 获得DNA片段，命名为TBS。
[0066] 将GFP-sense、GFP-anti-sense和TBS连接，将连接产物转入克隆菌株大肠杆菌 TGl中，鉴定获得质粒T-dsGFP。将质粒T-dsGFP进行BamHl和Sacl酶切，获得核苷酸片段 dsGFP〇
[0067] 2)获得可用于构建的启动子和终止子核苷酸片段。
[0068] 35S启动子（其序列如SEQ ID NO :2所示）和终止子（其序列如SEQ ID NO :3所 示）从pCambia 1300载体获得，使用的引物分别是：
[0069] 35PF_Hind :5' GCGAAGCTTgcacgacactctcgtctact，5' 端被设计上 HindIII 位点
[0070] 35PR_BamH :5' GTGGGATCCagctcgagagagatagatttg，5' 端被设计上 BamHI 位点
[0071] 35TF_Sacl: 5, GTGGAGCTCtccttcgcaagacccttcct，5' 端被设计上 SacI 位点；
[0072] 35TR_Kpnl: 5'GTGGGTACCtggattttagtactggattt，5' 端被设计上 KpnI 位点。
[0073] 将35PF-Hind和35PR-BamH为一对引物，以pCambia 1300载体为模板进行扩增， 对扩增出的PCR产物进行纯化得到DNA片段，再进行Hind3/BamH酶切并纯化并获得纯化后 的DNA片段，命名为35P。
[0074] 将35TF-Sacl和35TR-Kpnl为一对引物，以pCambia 1300载体为模板进行扩增， 对扩增出的PCR产物进行纯化得到DNA片段，再进行Sacl/Kpnl酶切并纯化获得纯化后的 DNA片段，并命名为35T。
[0075] 3)拼接 dsGFP 和 35T 片段
[0076] 将pUCmT载体以BamHl和Kpnl进行酶切并纯化获得DNA片段，命名为TBK。 将dsGFP、35T和TBK连接，将连接产物转入克隆菌株大肠杆菌TGl中，鉴定获得质粒 T-dsGFP-T。将质粒T-dsGFP-T进行BamHl和Kpnl酶切获得核苷酸片段dsGFP-T。
[0077] 4) T-DNA 载体构建
[0078] 将pCambia 1300载体以HindIII和KpnI进行酶切获得核苷酸片段1300-HK，将 1300-HK、35P和dsGFP-T进行连接，将连接产物转入克隆菌株大肠杆菌TGl中，鉴定获得可 用于农杆菌植物转化的含有T-DNA载体的质粒1300-35-dsGFP。
[0079] 将质粒1300-35-dsGFP转入农杆菌菌株LBA4044中，以此农杆菌进行植物转化。拟 南芥的转化委托武汉双螺旋生物科技有限公司进行，获得转基因拟南芥种子。
[0080] 实施例2转基因植物中总RNA的提取
[0081] 使用Trizol的方法抽取转基因拟南芥组织总RNA。本实例具体操作步骤如下：
[0082] 1)将转基因拟南芥组织和液氮加入研钵中，充分研磨。
[0083] 2)将研磨后的粉末50mg移至2ml离心管中，向离心管中加 ImL Trizol，剧烈振荡 混匀30秒后，立即置冰上放置15分钟，4°C 12000r/分钟离心15分钟。
[0084] 3)取步骤2)所得的水相（位于上层），加入等体积酚/氯仿（1:1)混匀，剧烈振 荡10分钟，4°C 12000rpm离心15分钟。
[0085] 4)取步骤3)所得的水相（位于上层），加入等体积氯仿，剧烈振荡10分钟，再同 上离心（4°C 12000rpm离心15分钟）。
[0086] 5)取步骤4)所得的水相（位于上层），重复步骤3) +步骤4)。
[0087] 6)取步骤5)所得的水相（位于上层）加入等体积的预冷的异丙醇（或异戊醇） 混匀，零下20°C放置20分钟，再同上离心（4°C，12000rpm离心15分钟）。
[0088] 7)取步骤6)所得的沉淀用70%乙醇洗两次，室温下干燥10分钟，溶于DEPC处理 的去离子蒸水50ml中以溶解RNA，分装，-20°C冻存。
[0089] 8) RNA质量和浓度检测。取2 μ 1步骤7)提取所得的RNA，检测其260nm和280nm 的吸光值，分别为 260nm 数值（0D260) = 5. l，280nm 数值（0D280) = 2.6, 0D260/0D280 = 1. 96。根据RNA纯度标准，0D260/0D280在1. 8-2. 0之间为高纯度RNA，故本实施例获得了 高纯度RNA。根据RNA浓度（μ g/mL)计算公式：0D260值X 40ng/ μ 1，本实施例获得的RNA 浓度为204ng/ μ 1，符合后续试验标准。
[0090] 实施例3转基因植物中dsRNA的检测
[0091] 为了确定植物中dsRNA已经表达，使用Northern杂交的方法检测植物中dsRNA的 产生。
[0092] 使用实施例2的方法提取1株非转基因作物和2株不同株系转基因植物的叶片的 总RNA，编号分别为1号RNA(非转基因）、2号RNA(转基因）、3号RNA(转基因）。
[0093] 具体操作步骤如下：
[0094] 1)在离心管内，将10 μ I 1号RNA样品、2号RNA样品、3号RNA样品分别和5 μ IRNA 上样缓冲液混匀，获得1号、2号和3号RNA上样溶液。
[0095] 2)将离心管盖严，将RNA上样溶液90°C温育5分钟后，立刻用将样品放在冰上10 分钟，将dsRNA变成单链RNA。将RNA上样溶液离心lOOOOrpm，5秒钟，使管内所有液体沉降 至管底。
[0096] 3)灌制1 %琼脂糖水平凝胶，分析RNA上样溶液中总RNA含量。在三角瓶中加入 50ml的I X TBE为缓冲液和5g琼脂糖，微波炉中加热，琼脂糖溶解后，加入50 μ 10. 5mg/ml 的溴化乙锭溶液，将琼脂糖溶液倒入制胶板中，冷却凝固形成1%琼脂糖胶。用于RNA电泳 的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3% H2O2，于室温放置10分 钟后，用经DEPC处理的水彻底冲洗电泳槽。将1-3号RNA样品加至凝胶1-3加样孔，将凝 胶浸入I X TBE电泳液中，以3-4V/cm电压进行电泳。电泳结束后，在紫外灯下拍摄RNA染 色照片（如图2所示）。在图2中各个泳道RNA条带清晰，轮廓明显，没有大量模糊的拖带。 这说明在RNA上样溶液中RNA没有被降解，而且3个泳道中的样品RNA条带亮度一致，说明 3个泳道中的样品中RNA的上样量一致。
[0097] 4)将步骤3)中电泳后的凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝胶的无用部分， 在凝胶左上角（加样孔一端为上）切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。
[0098] 5)在玻璃皿内倒入20ml脱嘌呤缓冲液（0. 2M HC1)，室温摇动20分钟。
[0099] 6)移除玻璃皿中的脱嘌呤缓冲液，倒入20ml变性缓冲液（50mM NaOH，1. 5M NaCl)，室温摇动20分钟。
[0100] 7)移除玻璃皿中的变性缓冲液，倒入20ml中和缓冲液（1M Tris，I. 5M NaCl，pH 7. 4)，室温摇动20分钟。
[010