中I为样品垫，2为连接垫(此处用碱性磷酸酶处理)，3为纤维膜，4为吸附垫，5为检测线(使用特异性探针处理)，6为控制线(使用通用探针处理)。
[0030]图2为试纸条检测结果显示示意图。其中，当检测线和控制线处均有条带时为阳性(如图2的左图)，当只有控制线有色时为阴性(如图2的右图)。
【具体实施方式】
[0031]以下结合非限制性的具体实施例来对本发明进行进一步的说明。
[0032]实施例中的核酸探针及引物均购于上海生工生物。
[0033]实施例1:人乳头瘤病毒(HPV)核酸的检测
[0034]1.HPV通用引物及探针的设计采购。均购于上海生工生物。
[0035]2.核酸试纸条的制备:如图1所示，在连接垫处使用碱性磷酸酶处理，然后在检测线处使用与目的产物能特异性杂交的探针进行处理；在控制线处使用通用探针，该通用探针被设计为与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物反向互补。
[0036]3.HPV核酸样本的提取:所述HPV核酸样本是从江苏省某医院HPV患者的宫颈脱落细胞标本提取的。用核酸提取试剂盒进行提取，主要利用煮沸裂解法进行核算的提取。
[0037]4.PCR扩增:根据步骤2和3中的试剂及核酸样本进行PCR体系配制，共20ul体系，包括19ul的PCR反应液和Iul的模板。其中，上游引物上标记有生物素。按照如下程序进行PCR扩增:
[0038]50 °C 2min, 94°C 4min ；
[0039]94°C 30sec, 60°C 45sec, 72°C 20sec, 35 cycles ；
[0040]4°C hold.
[0041]扩增完成后保存待用。
[0042]5.提前对步骤2中的核酸试纸条进行恒温处理，温度为40摄氏度。
[0043]6.向步骤4中的扩增产物加入扩展液及显示底物，混匀后向试纸条样品垫上滴加1ul，反应15分钟后观察结果。
[0044]7.根据试纸条上检测线，控制线的显色情况，具体显色情况如图2:当控制线和检测线都显色时，检测结果为阳性；当只有控制线显色时，检测结果为阴性；当控制线不显色时，实验过程有问题，需重新进行实验。
[0045]应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
【主权项】
1.一种核酸检测试纸条，其依次包括样品垫、连接垫、纤维膜和吸附垫，纤维膜上依次设置有检测线和控制线，其特征在于，所述连接垫上结合有碱性磷酸酶，所述检测线上结合有能与待检测的目的核酸杂交的特异性探针，所述控制线上结合有通用探针，并且所述通用探针与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补。2.—种核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求1所述的核酸检测试纸条，以及显色底物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述显色底物为3-氨基-9-乙基咔唑。4.一种制备根据权利要求1所述的核酸检测试纸条的方法，其包括如下步骤: 1)制备依次包括样品垫、连接垫、纤维膜和吸附垫，纤维膜上依次设置有检测线和控制线的试纸条； 2)在连接垫处用碱性磷酸酶处理； 3)在检测线处用与待检测的目的核酸杂交的特异性探针处理； 4)在控制线处用与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补的通用探针处理。5.一种用核酸试纸条来检测核酸的方法，包括如下步骤: 1)根据待检测的目的核酸制备与待检测的目的核酸杂交的特异性探针，并由此制备根据权利要求1所述的核酸检测试纸条或者根据权利要求2或3所述的核酸检测试剂盒； 2)提取并用被生物素标记的上游引物和/或下游引物通过PCR来扩增待检测的目的核酸，得到扩增产物； 3)对试纸条在20-60摄氏度、优选38-42摄氏度下进行提前温育10分钟以上，然后向步骤2)获得的扩增产物中加入扩展液和显色底物并混匀，向步骤I)制备得到的核酸检测试纸条或者核酸检测试剂盒中的核酸检测试纸条的样品垫上滴加1-100微升，优选为5-20微升，更优选为8-12微升混匀后的混合物，再在40摄氏度下温育5-60分钟、优选10-30分钟、更优选13-17分钟，观察结果，或者 向步骤2)获得的扩增产物中加入扩展液和显色底物并混匀，在向步骤I)制备得到的核酸检测试纸条或者核酸检测试剂盒中的核酸检测试纸条的样品垫上滴加1-100微升，优选为5-20微升，更优选为8-12微升混匀后的混合物的同时在38-42摄氏度下温育5_60分钟、优选10-30分钟、更优选10-15分钟，观察结果。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤I)中，在根据权利要求1所述的核酸检测试纸条或者根据权利要求2或3所述的核酸检测试剂盒中，通用探针与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物反向互补， 并且，在步骤2)中，上游引物被生物素标记。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤I)中，在根据权利要求1所述的核酸检测试纸条或者根据权利要求2或3所述的核酸检测试剂盒中，通用探针与扩增待检测目的核酸的PCR所用的下游引物反向互补， 并且，在步骤2)中，下游引物被生物素标记。
【专利摘要】本发明涉及一种核酸检测试纸条，其依次包括样品垫、连接垫、纤维膜和吸附垫，纤维膜上依次设置有检测线和控制线，其特征在于，所述连接垫上结合有碱性磷酸酶，所述检测线上结合有能与待检测的目的核酸杂交的特异性探针，所述控制线上结合有通用探针，并且所述通用探针被生物素标记与扩增待检测目的核酸的PCR所用的上游引物和/或下游引物反向互补。本发明还涉及包括所述试纸条的试剂盒、所述试纸条的制备方法，以及一种检测方法。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105002282
【申请号】CN201510456919
【发明人】刘泽涛, 杨华卫
【申请人】江苏猎阵生物科技有限公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月29日