的胞外多糖的含量降低，同时结合后续发酵液的提纯工艺，能够进一步降低所得 凝乳酶中的杂质，以提高类芽孢杆菌凝乳酶的回收率。使所得的凝乳酶粗提物，总糖含量 少，粘度降低，能够较好的满足工业化生产凝乳酶的需求。
【附图说明】
[0024] 图1为不同的接种量对上清液中总糖含量的影响。
[0025] 图2为不同的摇床转速对上清液中总糖含量的影响。
[0026] 图3为不同的发酵时间对上清液中总糖含量的影响。
[0027] 图4为不同的摇床转速对上清液中粘度、总糖浓度和凝乳酶活性的影响。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0029] 实施例中所述的"室温"是指常规的操作室内温度，一般为10~30°C。
[0030] 实施例中所述的各个试剂若无特别说明均为分析纯试剂，购自国药集团。
[0031] 实施例中所述的凝乳酶活力（MCA)值的测得包括以下的步骤：
[0032] 将类芽孢杆菌BD3526接种至TYC培养基（所述TYC培养基由以下组分组成：酪 蛋白胨 15g/L，鹿糖 50g/L，酵母膏 5. Og/L，L-胱氨酸 0· 2g/L，乙酸钠 20g/L，Na2SO4O. lg/L， NaCl lg/L，Na2HPO4 · 12H20 2g/L，NaHC032g/L，琼脂 15g/L，余量为水）中 35°C、180r/min 培 养16h作为种子使用，按9 %的接种至250mL锥形瓶中装有20mL的I %小麦麸皮培养基中 并混匀，于20°C，300r/min的条件下，震荡培养18h。培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸 皮培养基经4°C，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。
[0033] 将制备得到的500 μ L的粗酶液按照下述方法进行凝乳实验，凝乳酶活力（milk clotting activity，MCA)测定方法包括以下步骤：
[0034] 将脱脂奶粉以10% (w/v)的比例配置成pH 6. 0含有lOmmol/L CaCl2的溶液，在 35°C水浴中孵育IOmin后，将500 μ L的凝乳酶加入至35°C的IOmL脱脂乳溶液中，每15s将 样品取出并倾斜45°C观察样品组织状态，以形成不连续颗粒的时间计作凝乳时间。1个凝 乳酶单位（Soxhlet unite，SU)定义为35°C条件下，使ImL脱脂乳在40min发生凝乳所需 的酶量。
[0035]
[0036] 其中，T表示凝乳时间，单位为秒；Vs表示底物体积，单位为mL ;V ￡表示酶液体积， 单位为mL ;D表示稀释倍率。
[0037] 实施例中所述的糖含量的测得包括以下的步骤：
[0038] 制作标准曲线：准确称取标准葡萄糖IOmg于IOmL容量瓶中，加水至刻度配制 成葡萄糖标准液；分别吸取2、5、10、50和100 μ L葡萄糖标准液，分别添加蒸馏水补至 200 μ L，然后加入5%苯酚1.0 mL及98%硫酸5. OmL，摇匀冷却，所述百分比为质量百分比； 室温放置20分钟后，于490nm测光密度，以2. OmL蒸馏水作为空白对照，得标准曲线y = 0.002x+0. 043
[0039] R2= 0· 9984 (X 表示总糖浓度）。
[0040] 样品中总糖含量的测定：吸取用pH7. 0、0. 02mol/L的PBS溶液稀释后的凝乳酶的 粗提物200 μ L，然后加入5%苯酚0. 4mL及浓硫酸2mL，所述百分比为质量百分比；摇匀冷 却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以200 μ L蒸馏水作为空白对照，依据标准曲线 计算样品总糖含量mg/mL。
[0041] 实施例中所述的粘度值的测得包括以下的步骤：
[0042] 使用proRheo_R180型号粘度计，调节转速lOOOrpm，操作环境温度10°C，将样品倒 入样品槽内，转子旋转IOs后测定度数即可。
[0043] 实施例1
[0044] 将类芽孢杆菌BD3526接种于TYC培养基中30°C种子培养20小时获得种子液， 所述TYC培养基由以下组分组成：酪蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5. 0g/L，L-胱氨酸 〇· 2g/L，乙酸钠 20g/L，Na2SO4O. lg/L，NaCl lg/L，Na2HPO4 · 12H20 2g/L，NaHC032g/L，琼脂 15g/L，余量为水。
[0045] 将0. 8% (v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分 比为体积百分比，30°C、摇床震荡速度160r/min发酵培养72小时得BD3526发酵液。所述 麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为2%，余量为水。
[0046] 将BD3526发酵液于4°C、15000g条件下离心15分钟后收集上清液，得凝乳酶粗提 物。使用〇. 〇2mol/L、pH7. 0的PBS溶液将凝乳酶粗提物稀释3倍，测定凝乳酶粗提物中凝 乳酶活力（SU/mL)、总糖含量（mg/mL)和粘度（Pa · S)值，测定结果如表1所示。
[0047] 将硫酸铵固体粉末缓慢加入至凝乳酶粗提物中溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度 的60%，混合均匀后4°C静置2小时；静置后于4°C、15000g离心15分钟，得沉淀物。
[0048] 将沉淀物用ρΗ7· 0、0· 02mol/L的PBS溶液溶解后，4°C，15000g条件下离心10分 钟，弃沉淀，将上清液进行冻干处理，得到类芽孢杆菌BD3526麸皮液体发酵产生的粗凝乳 酶。
[0049] 表1凝乳酶粗提物测定结果
[0051] 实施例2
[0052] 将类芽孢杆菌BD3526接种于TYC培养基中30°C种子培养20小时获得种子液， 所述TYC培养基由以下组分组成：胰蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5. Og/L，L-胱氨酸 〇· 2g/L，乙酸钠 20g/L，Na2SO4O. lg/L，NaCl lg/L，Na2HPO4 · 12H20 2g/L，NaHC032g/L，琼脂 20g/L，余量为水。
[0053] 将0. 4% (v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分 比为体积百分比，28°C、摇床震荡速度180r/min发酵培养24小时得BD3526发酵液。
[0054] 将BD3526发酵液于4°C、15000g条件下离心15分钟后收集上清液，得凝乳酶粗 提物。将硫酸铵固体粉末缓慢加入至凝乳酶粗提物中溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的 60%，混合均匀后2°C静置0小时。
[0055] 其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
[0056] 测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力（SU/mL)、总糖含量（mg/mL)和粘度（Pa · S)值， 测定结果如表2所示。
[0057] 表2凝乳酶粗提物测定结果
[0059] 实施例3
[0060] 将3. 2% (v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分 比为体积百分比，30°C、摇床震荡速度180r/min发酵培养48小时得BD3526发酵液。
[0061] 将BD3526发酵液于4°C、15000g条件下离心15分钟后收集上清液，得凝乳酶粗 提物。将硫酸铵固体粉末缓慢加入至凝乳酶粗提物中溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的 60%，混合均勾后6°C静置5小时。
[0062] 其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
[0063] 测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力（SU/mL)、总糖含量（mg/mL)和粘度（Pa · S)值， 测定结果如表3所示。
[0064] 表3凝乳酶粗提物测定结果
[0066] 实施例4
[0067] 所述麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为1%，余量为水。
[0068] 将0. 8% (v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分 比为体积百分比，30°C、摇床震荡速度180r/min发酵培养24小时得BD3526发酵液。
[0069] 其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
[0070] 测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力（SU/mL)、总糖含量（mg/mL)和粘度（Pa · S)值， 测定结果如表4所示。
[0071] 表4凝乳酶粗提物测定结果
[0073] 实施例5
[0074] 所述麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为5%，余量为水。
[0075] 将I. 6% (v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分 比为体积百分比，30°C、摇床震荡速度170r/min发酵培养72小时得BD3526发酵液。
[0076] 其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
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