077] 测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力（SU/mL)、总糖含量（mg/mL)和粘度（Pa. S)值，测 定结果如表5所示。 「00781 耒5凝乳_ffl搵物涮宙结里
[0080] 实施例6
[0081] 将2. 4% (v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分 比为体积百分比，30°C、摇床震荡速度160r/min发酵培养48小时得BD3526发酵液。
[0082] 其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
[0083] 测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力（SU/mL)、总糖含量（mg/mL)和粘度（Pa. S)值，测 定结果如表6所示。
[0084] 表6凝乳酶粗提物测定结果
[0086] 实施例7
[0087] 分别将0· 4%、0· 8%、1· 6%、2· 0%、2· 4%和3. 2% (v/v)的种子液接种于含有 50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分比为体积百分比，其余条件和操作步骤均与 实施例1完全相同。
[0088] 测定凝乳酶粗提物中的总糖含量（mg/mL)，测定结果如表7所示（参见图1)。
[0089] 表7凝乳酶粗提物测定结果
[0091] 表7的结果说明，BD3526麸皮培养液中的总糖含量，随着TYC种子液的加入量的 增加，其糖含量也不断增加，可以看出种子液的接入量对于发酵上清糖含量有重要的影响。
[0092] 实施例8
[0093] 30°C、摇床震荡速度分别为160r/min、170r/min和180r/min，发酵培养48小时得 BD3526发酵液。
[0094] 其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
[0095] 测定凝乳酶粗提物中的总糖含量（mg/mL)，测定结果如表8所示（参见图2)。
[0096] 表8凝乳酶粗提物测定结果
[0097]
[0098] 表8的结果说明，BD3526麸皮发酵液中的总糖含量，与锥形瓶培养过程中转速也 有着密切关系。在160~180r/min范围内，随着摇床转速的增加，发酵上清的总糖含量也 不断增加。
[0099] 实施例9
[0100] 分别发酵培养24、48和96小时得BD3526发酵液。
[0101] 其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
[0102] 测定凝乳酶粗提物中的总糖含量（mg/mL)，测定结果如表9所示（参见图3)。
[0103] 表9凝乳酶粗提物测定结果
[0104]
[0105] 表9的结果说明，随着摇床培养时间的延长，发酵液上清中总糖含量不断降低，可 能是部分糖类被菌种利用代谢，因此，麸皮培养BD3526时间对发酵液上清总糖含量也有较 大的影响作用。
[0106] 对比实施例1
[0107] 分别将0. 1%、0. 2%、3. 6%和4. 0% (v/v)的种子液接种于麸皮培养基中。
[0108] 其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
[0109] 测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力（SU/mL)、总糖含量（mg/mL)和粘度（Pa. S)值，测 定结果如表10所不。
[0110] 表10凝乳酶粗提物测定结果
[0111]
[0112] 对比实施例2
[0113] 设定摇床发酵培养的温度30°C，摇床的震荡的速度为160r/min，分别培养6小时、 12小时、84小时、96小时，收集BD3526发酵液；
[0114] 其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
[0115] 测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力（SU/mL)、总糖含量（mg/mL)和粘度（Pa. S)值，测 定结果如表11所不。
[0116] 表11凝乳酶粗提物测定结果
[0118] 对比实施例3
[0119] 30°C、摇床震荡速度分别为140r/min、170r/min和300r/min，发酵培养48小时得 BD3526发酵液。
[0120] 其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
[0121] 测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力（SU/mL)、总糖含量（mg/mL)和粘度（Pa. S)值，测 定结果如表12所示（参见图4)。
[0122] 表12凝乳酶粗提物测定结果
[0124] 表10~12说明，摇床转速、接种量以及发酵时间对粗凝乳酶溶液中的糖含量影响 较大。一定范围内，摇床转速越低、接种量越少、发酵时间越长，发酵上清液中糖含量就越 低，则其测定的粘度也越低，但超出本专利申请
【发明内容】
中设定的相关发酵参数的数据范 围，如转速过低、发酵时间过长时，则均会严重影响发酵液凝乳酶活力，而转速过快则会大 量增加发酵液中糖含量。同时，发酵液中糖含量越高，液体粘度越高，离心后上清液越浑浊， 会使上清黏度越大，且沉淀底部白色沉淀层越厚。
[0125] 因此，将类芽孢杆菌BD3526按0.4%~3.2% (体积百分数）接种于麸皮培养基 中震荡发酵培养，设定摇床温度为30°C，摇床转速160r/min~180r/min，连续培养24~72 小时，在此较佳工艺条件下所得的发酵上清凝乳酶活力可以达到2285. 71SU/mL，在保证凝 乳酶酶活的前提下，糖含量可以降低至1.33mg/mL，相对于高转速（300r/min)摇床培养，糖 含量可大幅降低64. 2% ;相对于短时发酵（12小时），糖含量降低72. 68% ;相对于高接种 量（4. 0% )，糖含量降低80. 41 %。因此，通过优化后的发酵条件，可有效地降低了发酵过程 中糖含量和发酵液粘度，易于工厂化操作。
[0126] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种 改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种制备类芽孢杆菌CGMCC No. 8333的凝乳酶粗提物的方法，其特征在于，其包括 以下的步骤： (1) 将保藏编号为CGMCC No. 8333的类芽孢杆菌的种子液以0. 4~3. 2%的接种量接 种于麸皮培养基震荡发酵培养24~72小时得发酵液，所述震荡发酵培养的转速为160~ 180r/min，所述百分比为体积百分比； (2) 将步骤（1)所得的发酵液离心取上清液即得凝乳酶粗提物。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为48~72小时。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述震荡发酵培养的转速为160~170r/ min〇4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子液的接种量为0. 8~3. 2 %，所述 百分比为体积百分比。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No. 8333的类芽孢杆菌 在种子培养基上进行种子培养获得种子液；所述的种子培养基为TYC培养基；所述种子培 养的时间为20小时；所述种子培养的温度为30°C ;所述的麸皮培养基包括麸皮和水，所述 麸皮的含量为1 %~5%，所述百分比为质量百分比；和/或，所述麸皮为小麦麸皮。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28~30°C;步骤（2) 所述离心的时间为15分钟；所述离心的温度为4°C;和/或，所述离心的速度为15000g。7. -种由权利要求1~6任一项所述的方法制得的凝乳酶粗提物。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括以下的步骤： (3) 将步骤（2)所得上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫酸铵的饱和度为 50~75%，静置混合液，离心收集沉淀物； (4) 将步骤（3)所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤⑶所述混合液中硫酸铵的饱和度为 60% ;步骤⑶所述静置的温度为2~6°C ;步骤⑶所述静置的时间为0~5小时；步骤 (4)中所述的溶解的溶剂为水或PBS溶液；和/或，步骤（4)还包括将步骤（4)所述上清液 冻干的步骤。10. -种由权利要求8~9任一项所述的方法制得的凝乳酶。
【专利摘要】本发明公开了一种类芽孢杆菌CGMCC？No.8333的凝乳酶粗提物及其制备方法。所述的方法包括以下的步骤：(1)将保藏编号为CGMCC？No.8333的类芽孢杆菌的种子液以0.4～3.2％的接种量接种于麸皮培养基震荡发酵培养24～72小时得发酵液，所述震荡发酵培养的转速为160～180r/min，所述百分比为体积百分比；(2)将发酵液离心取上清液即可。所述的凝乳酶粗提物，总糖含量少，粘度较低，便于后续进一步的纯化，较好地满足了工业化生产凝乳酶的要求。
【IPC分类】C12R1/01, C12N9/52
【公开号】CN105018450
【申请号】CN201510408813
【发明人】杭锋, 王钦博, 刘振民, 陈卫, 穆海波, 王国骄, 刘沛毅, 洪青, 雍靖怡, 齐晓彦
【申请人】光明乳业股份有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月13日