通过去 离子水透析的方法纯化（纤维素膜，截留分子量/MWC0为14000Da)，冻干后得到棕色固体 P1-F1-F7 (74mg)。该触发式自降解聚合物P1-F1-F7的结构的通过核磁氢谱与GPC进行表 征，结果分别显示于图2。这些核磁图谱和质谱数据都充分证明了所合成的单体结构。约有 8. 5个PEG45接枝到一个超支化分子上。
[0090]P1-F1-F7(0. 05g,马来酰亚胺基团含量 6ymol)、cRGD-SH(4mg, 9ymol，生工生物 工程公司）、200 1^01^0和1800 1^?85化117.4)加入有磁子的玻璃封管内。室温搅拌 24h后，产物经由去离子水透析纯化（纤维素膜，截留分子量/MWC0为3500Da)，冻干后得到 棕色固体Pl-Fl-F7-cRGD(38mg)。超支化聚合物P1-F1-F7-CR⑶能够直接溶解在水溶液中 形成较小的纳米粒子（图3)。
[0091] 外围触发基元为二硫键外围修饰了F8的P2-F8以及触发基元为苯硼酸外围修饰 了F3与F7以及靶向基元CGKRK的P3-F3-F7-CGKRK的超支化触发式自降解聚合物也已同 样的方法合成。
[0092]应用例1:超支化触发式自降解聚合物共价负载药物与控制释放[0093] 触发式自降解聚合物的支化桥联化学结构特征决定了它们必须以逐步的方式串 联解聚；因此从焦点处的触发基元被切断到报告基元释放呈现出一定的时间延迟。460nm可见光辐照脱去茈甲基触发基元后，在焦点处生成伯胺基，进而诱导聚合物从焦点到外围 的程序化解聚。不同结构的支化基元（M1-M3)、触发基元（如可见光触发的茈，对肿瘤细胞 内的醌氧化还原酶特异性响应的基元等）、外围功能基元（如阿霉素或氨基喜树碱药物）在 特定刺激下的触发解聚行为以及解聚动力学。
[0094] 实验条件，将P1-F1-F7-CRGD(0?lg/L)溶解在磷酸缓冲溶液中（pH7. 4)，然后加入 透析袋中（截留分子量3500Da)，使用460纳米LED灯光照30min，使用HPLC跟踪D0X的释 放，用GPC跟踪聚合物分子量。
[0095] 实验结果表明，P1-F1-F7-CRGD在三十分钟光照后停止光照，我们通过HPLC跟踪 了聚合物的解聚行为。聚合物的构筑基元的程序释放，而D0X的释放有一定的延时效果，6h 以后构筑基元和D0X都基本全部释放。GPC的表征同样表明在光照以后，GPC曲线向小分子 量部分变换，最终只残留聚乙二醇（见图4)。另外，超支化触发式自降解聚合物的内核中有 部分的疏水成分，从而能够负载尼罗红，同样的，光照以后聚合物解聚，从而负载的尼罗红 释放出来（见图5)。
[0096] 应用例2 :超支化触发式自降解聚合物用于静电络合DNA、RNA和治疗蛋白与可控 释放
[0097] 此外，还将利用超支化触发式自降解聚合物外围修饰的聚阳离子的多价性与触发 解离特性，实现DNA、siRNA或治疗性蛋白质的输运与响应性触发释放。外周修饰了PDMAEMA 短链（聚合度约为7~8)的触发式自降解聚合物能够与带负电荷的生物大分子（质粒DNA 和治疗性蛋白质RibonucleasesA等）生成聚离子复合物；而在PDMAEMA修饰的hSIP内核 发生触发降解后，短链的PDMAEMA将没有足够能力形成静电复合物，因此释放出质粒DNA或 蛋白质。
[0098]将P2-F8 (30mg/L)与pDNA(12mg/L，表达虫荧光素，Aldevron)分别溶解在HEPES 缓冲溶液中（pH7.4)作为储备液。将P2-F8溶液加入到pDNA的储备液中配成不同的氮膦 比（P2-F8的氨基数与pDNA的膦酸数之比），然后混合液在4°C下培养过夜。最后的pDNA 浓度调节到3mg/L。基因的释放过程使用谷胱甘肽进行刺激，络合物在GSH存在的条件下培 养过夜。基因转染过程使用标准的虫荧光素转染与检测的操作。
[0099] 实验结果表明P2-F8的基因转染能力随着N/P值的增加而加强，在N/P值为8时 达到最大，并且与不能解聚的超支化触发式聚合物的差异达到最大，而在N/P值大于8后， 转染效率下降，并且差异减小。这些结果的产生原因是，P2-F8/DNA的络合物在N/P值大于 4后能够结合完全，而N/P值大于16后不能够完全解离，因此转染效果会下降，而效果相似。 而P2-F8的效果与标准的基因传递材料聚乙烯亚胺相似，说明其有很好的基因传输效果， 之前的结果表明，其毒性较小，能够用于基因载体（见图6)。
[0100] 应用例3 :超支化触发式自降解聚合物用于灵敏检测
[0101] 触发一分子超支化触发式自降解聚合物的解聚只需要一分子的触发信号分子，并 且能够释放出多分子的信号报告分子；因此提高末端报告基元的数量将能够相应地提高输 出信号的化学放大效率。设计苯硼酸酯为触发基元用于检测h202，并研究末端基元数目、报 告基元种类（如香豆素和罗丹明）及其功能化效率化学放大效率及检测灵敏度的影响。此 外，与小分子探针溶解在整个溶液中不同，在骨架外围共价连接了多个荧光报告基元，其相 互之间的自淬灭效应将能够降低初始荧光，进一步降低背景噪音和提升检测灵敏度。另一 方面，由于线粒体是细胞内主要的能量转换场所，一部分的氧在线粒体内转变为H202，因此 线粒体内的H202含量是一项细胞状态的重要指标。采用外围修饰了线粒体靶向基元（CGKRA肽）的超支化触发式自降解聚合物来检测线粒体内的H202。
[0102] 具体的实验为，将P3-F3-F7-CGKRK(0.lg/L)溶解在磷酸缓冲溶液中（pH7. 4)，然 后加入透析袋中（截留分子量3500Da)，加入设定浓度的过氧化氢，使用HPLC跟踪F3的 释放，用荧光跟踪荧光的变化。结果表明，P3-F3-F7-CGKRK能够在过氧化氢的条件下发生 解聚，然后释放出香豆素而发出荧光。该荧光的荧光的增强是因为分子内电荷转移的机 制，因此其吸收光谱有吸收峰的移动。荧光的增强在4h内达到最大，然后不再变化，其增 强倍率要大于小分子，由于P3-F3-F7-CGKRK上修饰了多个香豆素，因此相互之间存在自淬 灭，从而提高检测效果。而如果在能放出相同香豆素的浓度下，加入少量的过氧化氢培养 足够的时间，可以看到P3-F3-F7-CGKRK比不具备放大效果的荧光强度更强，检测下限为 0. 02yM(见图 7)。
[0103] 以上已对本发明进行了详细描述，但本发明并不局限于本文所描述具体实施方 式。本领域技术人员理解，在不背离本发明范围的情况下，可以作出其他更改和变形。本发 明的范围由所附权利要求限定。
【主权项】
1. 一种支化单元，所述支化单元含有一个酰基叠氮基元和两个羟基，所述酰基叠氮基 元和羟基之间通过触发式自降解基元连接，所述支化单元的结构如下所示：Ml:X= 0,R1= -CH2OH,R2=H M2:X= 0,R2=-CH20H,R1 =CH3 M3:X=S,R1= -CH2OH,R2=H。2. -种结构如式1所示的超支化触发式自降解聚合物，所述超支化触发式自降解聚合 物由权利要求1所述的支化单元通过缩合聚合制备，其中Tl是保护基元，当Tl脱去后，所 述超支化触发式自降解聚合物能够解离成组成的小分子片段：4. 一种式2所示的功能性超支化触发式自降解聚合物，其中F是功能基元，当Tl脱去 后，所述超支化触发式自降解聚合物自发分解并且能够释放出F:5. 根据权利要求4所述的功能性超支化触发式自降解聚合物，其中功能基元F可以选 自药物、荧光基元、酶底物、靶向基元以及亲水功能聚合物或其组合。6. 根据权利要求4所述的功能性超支化触发式自降解聚合物，其中，7.根据权利要求4所述的功能性超支化触发式自降解聚合物，所述功能性超支化触发 式自降解聚合物还在其上连结有靶向基元TG，形成如下式3所示结构，所述靶向基元TG为 对特定病变组织或者病变细胞具有靶向能力的多肽或者小分子，9. 一种控制超支化触发式自降解聚合物解离的方法，包括以下步骤： 1) 制备如权利要求4-8任一项所述的功能性超支化触发式自降解聚合物的水分散液； 2) 刺激所述功能性超支化触发式自降解聚合物，脱出端基保护基元Tl; 其中，所述刺激可以包括化学的或物理的刺激，所述化学的刺激包括谷胱甘肽、酯酶， 所述物理的刺激包括光。10. 根据权利要求4-8任一项所述的功能性超支化触发式自降解聚合物用于药物载体 或基因递送载体或用于细胞内生命活性物质灵敏检测的用途。
【专利摘要】本发明涉及超支化触发式自降解聚合物，以及涉及功能化超支化自降解聚合物的制备方法和应用。更具体地，所述的超支化触发式自降解聚合物由含有一个酰基叠氮和两个羟基的支化单元缩合聚合而成，并且在焦点处用刺激基元保护，其分子量为2000～15000Da。功能化的超支化触发式自降解聚合物通过所述超支化触发式自降解聚合物进行后改性，修饰上药物、荧光基元、酶底物、靶向基元以及亲水功能聚合物而制备。通过使用上述功能化的超支化触发式自降解聚合物，本发明实现了超支化触发式自降解聚合物共价或者非共价负载的药物分子或者基因的程序可控释放，以及灵敏检测。
【IPC分类】G01N21/25, C07C247/24, C08G18/71, C07C323/60, C08G18/83, C12N15/87
【公开号】CN105037200
【申请号】CN201510289701
【发明人】刘世勇, 刘固寰
【申请人】中国科学技术大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年5月29日