)。将反应混合物在80°C加热15小时，然后加入水（IOmL)。水层用 二氯甲烷萃取（3XIOmL)。合并的有机层经硫酸钠干燥并且过滤。在将滤出物真空浓缩之 后，残余物经硅胶色谱纯化（洗脱体系：CH2Cl2/Me0H:95/5)，得到化合物（385mg，89. 3% )， 为白色固体。1HNMR(400MHz，CDC13):Sh 7.88(s，lH)，7.28-7.39(m，5H)，7.14-7.16(m，lH) ，7. 08 (s，1H)，7. 02 (d，J= 8. 0Hz，1H)，3. 76 (m，4H)，2. 45-2. 55 (m，5H)，2. 37-2. 39 (m，4H)，2 ? 22-2. 29(m，5H)，I. 54-1. 55(m，2H).MS(ESI)m/e[M+l]+432. 0。
[0246] 下述化合物，即化合物3. 7至3. 10由相应试剂开始采用对化合物3. 6类似的操作 来合成。
[0247] 实施例4:合成化合物4. 1至4. 11
[0248] 化合物4. 1和4. 2
[0249] 5- (3, 5-二甲基异噁晔-4-基）-3-羟基-3-(噻吩-3-基）二氢吲哚-2-酮和 5-(3, 5-二甲基异噁晔-4-基）-3-羟基-3-(2-氣代丙基）二氢吲哚-2-酮
[0250] 用氣气吹洗火焰干燥的Schlenk管，在其中将145mg(0? 56mmol, 3mol% )Rh(acac) (C2H4)# 405mg(1.31mol，7mol%)三苯基膦溶于200mL丙酮中。在室温搅拌5分钟之 后，加入4. 54g(18. 75mmol)底物5-(3, 5-二甲基异噁唑-4-基）二氢吲哚-2, 3-二酮和 4. 8g(37. 5_〇1)噻吩-3-基硼酸，将所生成的混合物在回流温度搅拌。在40小时后，将 反应混合物冷却至室温，然后减压蒸发溶剂。将两种产物经柱色谱纯化（使用对TLC所 报道的洗脱条件），得到两种白色固体。它们的结构已经NMR和LC/MS得到确认。保留 时间短的化合物为5- (3, 5-二甲基异噁唑-4-基）-3-羟基-3- (2-氧代丙基）二氢吲 哚-2-酮：1HNMR(400MHz，DMS0-d6) :SH10. 33 (s，1H)，7. 26 (d，J=I. 6Hz，1H)，7. 18 (dd，J =I. 6, 8. 0Hz, 1H), 6. 80 (d,J= 8. 0Hz, 1H), 6. 12 (s, 1H), 3. 35 (d,J= 16. 4Hz, 1H), 3. 01 (d,J =16. 4Hz, 1H), 2. 37(s, 3H), 2. 19(s, 3H), 2. 02(s, 3H).MS(ESI)m/e[M+l]+301 ;保留时间长 的化合物为5- (3, 5-二甲基异噁唑-4-基）-3-羟基-3-(噻吩-3-基）二氢吲哚-2-酮：1H NMR(400MHz,DMS〇-d6) : 8H 10. 47 (s, 1H), 7. 47 (dd,J= 4. 8, 3. 2Hz, 1H), 7. 22-7. 26 (m, 3H) ,7. 13 (d,J= 4. 8Hz, 1H), 6. 96 (d,J= 8. 0Hz, 1H), 6. 65 (s, 1H), 2. 36 (s, 3H), 2. 19 (s, 3H).MS(ESI)m/e[M+l]+327〇
[0251] 实施例 4.Ia和 4.Ib
[0252] 通过手性制备型HPLC将化合物4.I拆分成两种对映异构体（SP，化合物4.Ia-保 留时间短的异构体和化合物4.Ib-保留时间长的异构体）。手性分离条件如下：
[0254] 步骤1:3-氯-5- (3, 5-二甲基异噁晔-4-基）-3-(噻吩-3-基）二氢吲哚-2-酮
[0255] 在0°C，向5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基）-3_羟基-3-(噻吩-3-基）二氢吲 哚-2-酮（500mg，I. 53mmol)于CH2C12(75.OmL)中的溶液中，加入吡啶（I. 21g，15. 3mmol)， 然后加入S0Cl2(728mg，6. 12mmol)。将反应混合物在0°C搅拌2小时，将混合物真空蒸发， 得到粗产物，将其用于下一步骤而没有进一步纯化。
[0256] 步骤2:5- (3, 5-二甲基异噁晔-4-基）-3- (2-羟基乙氨基）-3-(噻吩-3-基）二 氢吲哚-2-酮
[0257] 将IlOmg(0? 33mmol) 3-氯-5-(3, 5-二甲基异噁唑-4-基）-3-(噻 吩-3-基）二氢吲哚-2-酮和 220mg(l. 65mmol)DIPEA溶于 25ml012(：12中。在加入 55mg(0.65mmol)2-氨基乙醇之后，将反应溶液在室温搅拌16小时。接着，溶液用水稀 释。水相用CH2Cl2(2X20mL)萃取。合并有机相，用NaHOVK溶液和水洗涤，干燥，并 且真空浓缩。所生成的残余物经色谱纯化（洗脱体系：CH2Cl2/MeOH= 20/1)，得到产物 (85mg, 69.8%)，为白色固体。1HNMR(400MHz,DMS0-d6):SH7. 48-7.50m，lH), 7.20-731 (m, 3H), 6. 97 (d,J= 8. 0Hz, 1H), 4. 47 (t,J= 5. 6Hz, 1H), 3. 20-3. 38 (m, 4H), 3. 17 (d,J= 5. 3Hz, 2H), 2. 37(s, 3H), 2. 20(s, 3H).MS(ESI)m/e[M+l]+370。
[0258] 下述化合物，即化合物4. 4至4.IOb由相应的试剂开始根据对化合物4. 3所述类 似的操作来合成。
[0260] 5-(3, 5-二甲基异噁晔-4-基）-3-(噻吩-3-基）二氢吲哚-2-酮
[0261] 向5-(3, 5-二甲基异噁唑-4-基）-3_羟基-3-(噻吩-3-基）二氢吲哚-2-酮 (50mg，0. 153mmol)于三氟乙酸（IOmL)中的溶液中，加入三乙基硅烷（5mL)。将棕色溶液在 环境温度搅拌3小时，然后真空浓缩干燥。残余物用二氯甲烷（20mL)稀释，用饱和氯化铵 溶液（IOmL)、盐水（3X20mL)洗涤，然后经无水硫酸钠干燥，并且过滤。将滤液真空浓缩干 燥。残余物经柱色谱纯化，得到标题化合物（37mg，78. 0%)。1HNMR(400MHz，DMS0-d6) :SH 10. 62 (s, 1H), 7. 53 (m, 1H), 7. 31-7. 32 (m, 1H), 7. 22 (d,J= 8. 0Hz, 1H), 7. 16 (s, 1H), 7. 02 -7. 03 (m, 1H), 6. 97 (d,J= 8. 0Hz, 1H), 4. 90 (s, 1H), 2. 35 (s, 3H), 2. 18 (s, 3H).MS(ESI)m/ e[M+l]+311。
[0264] 将盐酸轻胺（6. 67g, 96mmol)于水（15mL)中的溶液加至2, 2, 2-三氯-1-乙氧基 乙醇（6. 96g, 36mmol)和硫酸纳（38. 3g, 270mmol)于水（45mL)和 2NHCl(30mL)中的悬浮 液中。将混合物在60°C搅拌20分钟。加入4-溴-2-甲氧基苯胺（6. 06g, 30mmol)于2N HCl(30mL)中的溶液，将混合物加热至90°C，保持2小时。将混合物冷却至室温。过滤收集 固体，用水洗涤，空气干燥，得到标题化合物（5. 55g，粗物质，68%产率）。将该物质用于下 一步骤，而没有进一步纯化。MS(ESI)m/e[M+l]+273,275。 步骤2:5-溴-7-甲氣基二氢吲哚-2, 3-二酮
[0265] 向65 °C的浓H2SO4 (30ml)中，分批加入N- (4-溴-2-甲氧基苯基）-2-(羟基亚氨 基）乙酰胺（5. 55g，20mmol)。将混合物在90°C加热I. 5h。将反应混合物冷却至室温，倾倒 至冰上，然后搅拌10分钟。过滤收集固体，用水洗涤，空气干燥，得到5-溴-7-甲氧基二氢 吲哚-2, 3-二酮（3. 6g，粗产物，70%产率）。将该物质用于下一步而没有进一步纯化。1HNM R(400MHz，DMS0-d6) :SH7. 93(s，1H)，7. 38(s，1H)，3. 94(s，3H).MS(ESI)m/e[M+l]+256, 258。
[0266] 步骤3:5' -溴-7' -甲氣基螺「「1, 31二氣杂戊环-2, 3' -二氢吲哚1-2' -酮
[0267] 使用Dean-Stark装置，将 5-溴-7-甲氧基二氢吲噪-2, 3-二酮（3. 6g, 14mmol)、 对甲苯磺酸（I. 14g, 6mmol)和甲苯（IOOmL)的搅拌混合物回流0. 2h。加入乙二醇 (9. 3g, 150mmol，10. 7eq.)，然后使用Dean-Stark装置再回流2小时。将混合物冷却，并且 浓缩至2〇111匕加入￡丨(^(10〇1^)，用水（2〇1^)和盐水（5〇1111^2)洗涤，经似 2304干燥，过 滤并且减压浓缩。经柱色谱纯化（CH2CL2/EtOAc= 8:1)，得到期望的化合物，为浅褐色固体 (0.218，粗产物，5%)。111匪1?(4001抱，0150-(1 6):5"10.66(8，111)，7.48(8，111)，7.26-7.2 7(m, 1H),7. 13-7. 14(m, 1H), 4. 25-4. 31 (m, 4H), 3. 86 (s, 3H).MS(ESI)m/e[M+l]+300/302〇
[0268] 步骤4:5' -(3, 5-二甲基异噁晔-4-基）_7' -甲氣基螺「「1, 31二氣杂戊 环-2, 3' -二氢吲哚1-2' -酮
[0269] 将 3, 5-二甲基异噁唑-4-基硼酸（298mg, 2.lmmol)、[1, 1'-二（二叔丁基膦 基）二茂铁]二氯化钯（II) (29mg, 0? 14mmol)、5' -溴-7' -甲氧基螺[[1, 3]二氧杂戊 环-2,3'-二氢吲哚]-2'-酮（21011^，0.7臟〇1)和似2〇)3(23311^，2.1臟〇1)于二噁烷（91111) 和水（2mL)中的混合物加热至102°C，保持16小时。向混合物中加入Et0Ac(50mL)、水 (20mL)。分离有机层，用水（20mL)、盐水（IOmL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且真空浓缩。 经柱色谱纯化（使用33%EtOAc/二氯甲烷化合物作为洗脱体系），得到期望的产物，为浅 褐色固体（57mg，粗物质，26%)。1HNMR(400MHz，DMS0-d6):Sh 10.62(s，lH)，7.02-7.03(m ,1H), 6. 92-6. 93 (m, 1H), 4. 26-4. 34 (m, 4H), 3. 86 (s, 3H), 2. 38 (s, 3H), 2. 10 (s, 3H).MS(ESI) m/e[M+l]+317。
[0270] 步骤5:5-(3, 5-二甲基异噁晔-4-基）-7-甲氣基二氢吲哚-2, 3-二酮
[0271] 将化合物5'_(3,5_二甲基异噁唑-4-基）_7'_甲氧基螺[[1，3]二氧杂戊 环-2, 3' -二氢吲噪]-2' -酮（57mg, 0. 18mmol)、乙酸（ImL)溶液和氯化氢溶液（4mL)加 热至90°C。在1.5小时后，将混合物冷却，加入Et0Ac(20mL)，用盐水洗涤（15mLX3)，经 Na2SO4干燥，真空浓缩，得到期望的化合物5-(3, 5-二甲基异噁唑-4-基）-7-甲氧基二氢 吲哚-2, 3-二酮，为暗红色固体（50mg，粗产物，102% )。该物质用于下一步骤，而没有进一 步纯化。MS(ESI)m/e[M+l]+273。
[0272] 步骤6:5- (3, 5-二甲基异噁晔-4-基）-3-羟基-7-甲氣基-3-苯基二氢吲 哚-2-酮
[0273] 将5_(3, 5-二甲基异噁唑-4-基）-7_甲氧基二氢吲哚-2, 3-二酮 (45mg, 0. 165mmol)和无水THF(1. 5mL)的悬浮液滴加至苯基溴化镁于2-甲基四氢咲喃 的溶液（2. 9M/L，0. 3mL，0. 87_〇1)中。将反应混合物在室温搅拌3小时。反应混合物用 EtOAc(30mL)洗涤，用饱和NH4Cl(IOmL)水溶液，盐水（3XIOmL)洗涤，经无水Na2SO4干燥， 过滤并且真空浓缩，经制备型TLC(CH2Cl2:EtOAc= 3:2)纯化，得到期望的产物，为浅褐色固 体（28mg，48%)。1HNMR(400MHz，DMS0-d6) :SH10. 56 (s，1H)，7. 31-7. 32 (m，5H)，6. 95-6. 9 6 (m, 1H), 6. 69-6. 71 (m, 2H), 3. 89 (s, 3H), 2. 35 (s, 3H), 2. 18 (s, 3H).MS(ESI)m/e[M+l] +351 〇
[0274] 实施例6:合成化合物6. 0
[0275] 2-(二甲氨基）-N- (5- (3, 5-二甲基异噁晔-4-基）-2-氣代-3-苯基二氢吲 P朵-3-基）acetamide
[0276] 在室温将 2_(二甲氨基）乙酸盐酸盐（87mg, 0? 62mmol)、HATU(118mg, 0? 31mmol) 和Et3N(94mg, 0. 93mmol)于Ol2Cl2(IOmL)中的溶液搅拌0. 5小时，然后加入3-氨 基-5-(3, 5-二甲基异噁唑-4-基）-3-苯基二氢吲哚-2-酮（lOOmg，0. 31mmol)，将混合 物再搅拌12小时。加入水（10mL)，混合物用CH2C12(2x20mL)萃取，合并有机相，用盐水 (20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，真空浓缩，混合物经柱色谱纯化，得到产物（50mg，40% )，为固 体。1HNMR(400MHz，DMS0-d6):SH 10.70(s，lH)，9.74(s，lH)，7.26-7.40(m，7H)，6.99(d，J =8. 0Hz, 1H), 4. 07 (d,J= 16. 0Hz, 1H), 3. 93 (d,J= 16. 0Hz, 1H), 2. 78 (s, 3H), 2. 71 (s, 3H) ，2. 38(s，3H)，2. 20(s，3H).MS(ESI)m/e[M+l]+405。
[0277] 81?2、81?3、81?4和81?1'生化1(：5。测定
[0278] 采用时间分辨荧光能量共振转移（TR-FRET)方法，对本申请公开的化合物的 BRD2、BRD3、BRD4和BRDT的作用进行测定。从N端带有His标签的大肠杆菌中表达和纯化 重组的人源BRD2 (1-473)、BRD3 (1-435)、BRD4 (1-477)和BRDT(1-397)。在含有 25mMHEPES pH7. 5、IOOmMNaCl、0. 1 %BSA、0. 05%CHAPS和检测试剂的缓冲液中，混合布罗莫结构域 蛋白、0-10yM化合物与四乙酰化组蛋白肽（SGRGacKGGacKGLGacKGGAacKRHGSGSK-生物素） 以进行测定。当蛋白、化合物和肽段达到结合平衡后，加入含有链霉亲和素标记的Tb穴状 化合物及XL665标记的抗-6xHis抗体的检测试剂。继续孵育一小时后，用BMGPHERAstar FS仪器记录TR-FRET信号。利用GraphpadPrism软件的四参数非线性回归方程：Y= Bottom+(Top-Bottom)/(l+l(T((LogIC5Q-X)*Hill斜率））对抑制百分比进行拟合，进而得 到每个化合物的IC5。。X为化合物的对数浓度，Y为在该浓度下的抑制百分比，Bottom为曲 线最低值，Top为曲线最高值，Hill斜率为Hill斜率因子。
[0279] 化合物I. 1 至 6. 0 对BRD2、BRD3、BRD4 和BRDT的IC5。范围为 0.InM至 10yM。
[0280] 表A:IC5。和EC5Q(nM)
【主权项】
1. 式I化合物、其立体异构体及其药用盐其中 R1为氢、卤素、杂原子官能团或烃基，所述烃基选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔 基和C6-C14芳基，其中每个烷基、烯基和炔基是任选环化的，每个烃基任选地被取代且任 选含有1至3个杂原子； R2为杂原子官能团或烃基，所述烃基选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基和C6-C14 芳基，其中每个烷基、烯基、炔基是任选环化的，每个烃基任选地被取代且任选含有1至3个 杂原子； R3为卤素、低级烷基、羟基、低级烷氧基或低级酰基；以及 n为 0、1、2 或 3。2. 根据权利要求1所述的化合物，其中： R1为卤素、-OR4或-NR5R6,或烃基，所述烃基选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基和C6-C14芳基，其中每个烷基、烯基和炔基是任选环化的，且每个烃基任选地被取代且任选含 有1至3个杂原子，其中R4、R5和R6各自独立是H或烃基，所述烃基选自C1-C8烷基、C2-C8 烯基、C2-C8炔基和C6-C14芳基，其中每个烷基、烯基和炔基是任选环化的，且每个烃基任 选地被取代且任选含有1至3个杂原子；或者R5和R6可与它们所连接的原子一起形成任选 取代的环烃基。3. 根据权利要求1所述的化合物，其中： R1为-OR4或-NR5R6,或烃基，所述烃基选自C3-C8环烷基、C5-C8环烯基和C6-C14芳基， 其中每个烃基任选地被取代且任选地含有1至3个杂原子；其中R4、R5和R6各自独立是H 或烃基，所述烃基选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基和C6-C14芳基，其中每个烷基、 烯基和炔基是任选环化的，且每个烃基任选地被取代且任选含有1至3个杂原子；或者R5和 R6可与它们所连接的原子一起形成任选取代的环烃基。4. 根据权利要求1所述的化合物，其中： R1为-OR4或-NR5R6,或C6-C14芳基，其中芳基是任选地被取代的且任选含1至3个杂 原子；以及R4、R5和R6各自独立是H或烃基，所述烃基选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8 炔基和C6-C14芳基，其中每个烷基、烯基和炔基是任选环化的，且每个烃基任选地被取代 且任选含有1至3个杂原子；或者R5和R6可与它们所连接的原子一起形成任选取代的环烃 基。5. 根据权利要求1所述的化合物，其中： R2为-OR4或-NR5R6,或烃基，所述烃基选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基和C6-C14芳基，其中每个烷基、烯基和炔基是任选环化的，且每个烃基任选地被取代且任选含 有1至3个杂原子，R4、R5和R6各自独立是H或烃基，所述烃基选自C1-C8烷基、C2-C8烯 基、C2-C8炔基和C6-C14芳基，其中每个烷基、烯基和炔基是任选环化的，且每个烃基任选 地被取代且任选含有1至3个杂原子，R5和R6可与它们所连接的原子一起形成任选取代的 环烃基。6. 根据权利要求1所述的化合物，其中： R2为-NR5R6,或烃基，所述烃基选自C3-C8环烷基、C5-C8环烯基和C6-C14芳基，其中每 个烃基任选地被取代且任选含1至3个杂原子，R4、R5和R6各自独立是H或烃基，所述烃基 选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基和C6-C14芳基，其中每个烷基、烯基和炔基是任选 环化的，且每个烃基任选地被取代且任选含有1至3个杂原子，R5和R6可与它们所连接的 原子一起形成任选取代的环烃基。7. 根据权利要求1所述的化合物中： R2可以是-NR5R6,或C6-C14芳基，其中芳基是任选取代的且任选含1至3个杂原子，R4、R5和R6各自独立是H或烃基，所述烃基选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基和C6-C14 芳基，其中每个烷基、烯基和炔基是任选环化的，且每个烃基任选地被取代且任选含有1至 3个杂原子，R5和R6可与它们所连接的原子一起形成任选取代的环烃基。8. 根据权利要求1所述的化合物、其立体异构体及其药用盐，选自：9.根据权利要求1所述的化合物及其药用盐，选自下表中有立体构型的化合物：10?-种BRD4抑制剂，取代的5-(3, 5-二甲基异噁唑-4-基）二氢吲哚-2-酮。11. 根据权利要求10所述的BRD4抑制剂，其包含位于二氢吲哚的C3位置上有1或2 个取代基，其中所述取代基各自独立是卤素、杂原子官能团或烃基，所述烃基选自C1-C8烷 基、C2-C8烯基、C2-C8炔基和C6-C14芳基，其中每个烷基、烯基和炔基是任选环化的，且每 个烃基任选地被取代且任选含有1至3个杂原子。12. 根据权利要求10所述的BRD4抑制剂，包括位于二氢吲哚的C3位置上有2个取代 基，这些取代基各自独立是卤素、杂原子官能团或烃基，所述烃基选自C1-C8烷基、C2-C8烯 基、C2-C8炔基和C6-C14芳基，其中每个烷基、烯基和炔基是任选环化的，且每个烃基任选 地被取代且任选含有1至3个杂原子。13. 权利要求1-12中任一项所述的化合物，其具有BRD4抑制活性，其在BRD4时间分辨 荧光共振能量转移（TR-FRET)酶法测定实验中IC50值小于或等于10yM，该测定在所述化 合物和四乙酰化组蛋白肽的混合物中使用从大肠杆菌（E.coli)中表达和纯化的具有N-端 His标签的重组人BRD4 (1-477)布罗莫结构域。14. 一种药物组合物，包括治疗有效量的单位剂量形式的权利要求1-13中任一项所述 的化合物，及一种或多种药用载体。15. -种联合给药产品，包括治疗有效量的权利要求1-13中任一项所述的化合物和另 外一种有抗癌疗效的试剂。16. -种治疗与不期望BRD4活性相关的疾病的方法，包括给予有需要的人有效量的权 利要求1-13中任一项所述的化合物、其N-氧化物或前药，其中所述疾病是癌症。17. 权利要求1-13中任一项所述的化合物在制备用于治疗不期望BDR4活性相关疾病 的药物中的用途。
【专利摘要】本发明公开的是一类取代的5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)二氢吲哚-2-酮化合物、包含至少一种该取代的5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)二氢吲哚-2-酮化合物的药物组合物、其制备方法及其用于抑制BET家族的布罗莫结构域和治疗由BET家族的布罗莫结构域而引起的疾病如某些癌症的用途。
【IPC分类】C07D209/04, A61P35/00, A61K31/41, C07D413/04
【公开号】CN105102452
【申请号】CN201480017203
【发明人】任博, 周昌友, 王鹤翔
【申请人】百济神州有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年4月14日