[0059] c.酶混合物 10μ1 ;
[0060]d.无RNA/DNA酶水100μ1 ;
[0061]e.阳性对照pGM-173阳性质粒30μ1。
[0062] 4、用本发明试剂盒检测猪圆环病毒PCV1
[0063] (l)PCR总体系为25μ1。分别将本发明试剂盒中扩增预混液：12. 5μ1、三条引物 共3μ1、无RNA/DNA酶水6. 5μ1、提取样品的DNA模板3μ1、阳性对照pGM-173阳性质粒 3μ1、阴性对照无RNA/DNA酶水3μ1，加入到0. 2ml扩增管中。
[0064] (2)分别向上述扩增管中加入阳性对照3μ1、从猪肺脏组织中提取DNA模板 3μ1、阴性对照3μ1，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩 增：94°(：预变性21^11 ;941€2〇8，退火温度55.51€3〇8,721€2〇8,40个循环。直接在实时定 量扩增仪上观察扩增结果。
[0065] 5、结果分析
[0066] 根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于 35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可 以依扩增得到的Ct值根据标准曲线对起始样品中病毒含量进行准确定量。
[0067] 实施例2
[0068] 步骤1、2同实施例1。
[0069] 3、制备用于检测20头份的试剂盒
[0070] 本试剂盒由以下组分组成：
[0071] a. One Step RT-PCR buffer ：250 μ 1；
[0072] b.引物浓度均为lOpmol/μΙ的三条引物混合液60μ1，其中173bp上游引物 20 μ 1，173bp下游引物20 μ 1，探针引物20 μ 1 ;
[0073] c.酶混合物20 μ 1 ;
[0074] d.无RNA/DNA酶水200μ1;
[0075]e.阳性对照pGM-173阳性质粒60μ1〇
[0076] 4、用本发明试剂盒检测猪圆环病毒PCV1
[0077] (l)PCR总体系为25μ1。分别将本发明试剂盒中扩增预混液：12. 5μ1、三条引物 共3μ1、无RNA/DNA酶水6. 5μ1、提取样品的DNA模板3μ1、阳性对照pGM-173阳性质粒 3μ1、阴性对照无RNA/DNA酶水3μ1，加入到0. 2ml扩增管中。
[0078] (2)分别向上述扩增管中加入阳性对照3μ1、从猪肺门淋巴结中提取的DNA模板 3μ1、阴性对照3μ1、12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩 增：94°C预变性2min;94°C20s，退火温度55. 5°C30s，72°C20s，40个循环。直接在实时定 量扩增仪上观察扩增结果。
[0079] 5、结果分析
[0080] 根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于 35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可 以依扩增得到的Ct值根据标准曲线对起始样品进行准确定量。
[0081] 实施例3
[0082] 步骤1、2同实施例1。
[0083] 3、制备用于检测50头份的试剂盒
[0084] 本试剂盒由以下组分组成：
[0085]a. One Step RT-PCR buffer：625μ1；
[0086]b.引物浓度均为lOpmol/μΙ的三条引物混合液150μ1，其中173bp上游引物 50 μ 1，173bp下游引物50 μ 1，探针引物50 μ 1 ;
[0087]c.酶混合物50 μ 1 ;
[0088]d.无RNA/DNA酶水5〇0μ1;
[0089]e.阳性对照pGM-173阳性质粒150 μ 1〇
[0090] 4、用本发明试剂盒检测猪圆环病毒PCV1
[0091] (l)PCR总体系为25 μ1。分别将本发明试剂盒中扩增预混液：12. 5 μ 1、三条引物 共3 μ 1、无RNA/DNA酶水6.5 μ 1、提取样品的DNA模板3 μ 1、阳性对照pGM-173阳性质粒 3 μ 1、阴性对照无RNA/DNA酶水3 μ 1，加入到0. 2ml扩增管中。
[0092] (2)分别向上述扩增管中加入阳性对照3μ1、从猪肠系膜淋巴结中提取的DNA模 板3μ1、阴性对照3μ1、12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下 扩增：94°C预变性2min;94°C20s，退火温度55. 5°C30s，72°C20s，40个循环。直接在实时 定量扩增仪上观察扩增结果。
[0093] 5、结果分析
[0094]根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于 35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可 以依扩增得到的Ct值根据标准曲线对起始样品中病毒含量进行准确定量。
[0095] 实施例4
[0096] 步骤1、2同实施例1。
[0097] 3、制备用于检测100头份的试剂盒
[0098] 本试剂盒由以下组分组成：
[0099] a. One Step RT-PCR buffer :1250 μ 1；
[0100] b.引物浓度均为iopmol/μL的三条引物混合液300 μ1，其中173bp上游引物 100 μ 1，173bp下游引物100 μ 1，探针引物100 μ 1 ;
[0101] c.酶混合物100μΙ;
[0102]d.无RNA/DNA酶水1ml;
[0103] e.阳性对照pGM-173阳性质粒300 μ 1。
[0104] 4、用本发明试剂盒检测猪圆环病毒PCV1
[0105] (l)PCR总体系为25 μ1。分别将本发明试剂盒中a.扩增预混液：12. 5 μ 1 ;b.三 条引物共3 μ 1 ;c.无RNA/DNA酶水6.5 μ 1 ;e.提取样品的DNA模板3 μ 1 ;f.阳性对照 pGM-173阳性质粒3 μ 1 ;g.阴性对照无RNA/DNA酶水3 μ 1，加入到0. 2ml扩增管中。
[0106] (2)分别向上述扩增管中加入阳性对照3μ1、从猪颂下淋巴结中提取的DNA模板 3μ1、阴性对照3μ1、12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩 增：94°C预变性2min;94°C20s，退火温度55. 5°C30s，72°C20s，40个循环。直接在实时定 量扩增仪上观察扩增结果。
[0107] 5、结果分析
[0108] 根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于 35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可 以依扩增得到的Ct值根据标准曲线对起始样品中病毒含量进行准确定量。
【主权项】
1. 一种用于检测猪圆环病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR试剂盒，所述试剂盒包含 扩增预混液、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQIDN0:1至SEQIDN0:2的引物及SEQID NO:3的探针引物的混合物，其特征在于所述序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:2的引物序列 为： SEQIDN0:1 :上游引物GAAAGGTAGGGGTAGGGGGTTGGT; SEQID2. 根据权利要求1所述的一种用于检测猪圆环病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR试 剂盒，其特征在于所述探针引物序列为： SEQIDN0:3 ：CCGCCTGAGGGGGGGAGGAACTG〇3. 根据权利要求1所述的猪圆环病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR试剂盒，其特征在 于所述引物混合物扩增出的条带序列为： SEQIDN0:1至SEQIDN0:2的由5'端向3'端延长的序列： SEQIDNO:4 (173bp)： gaaaggtaggggtagggggttggtgccgcctgagggggggaggaactggccgatgttgaaccgcagctggt taacattccaagatggctgcgagtgtcctccttctatggtgagtacaaattctctagaaaggcgggaattgaagat acccgtctttcggcgccatctgtaac〇4. 根据权利要求1、2或3所述的一种用于检测猪圆环病毒PCVl的Taqman Real-timePCR试剂盒，其特征在于所述引物浓度均的lOpmol/μL，扩增引物及探针引物体 积配比为1:1:1。5. 根据权利要求1所述的一种用于检测猪圆环病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR试 剂盒，其特征在于所述阳性对照为构建的PGM-173阳性质粒以及利用其制作的标准曲线。6. -种如权利要求1所述检测猪圆环病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR试剂盒的使 用方法，其特征在于所述实时荧光定量RT-PCR包括以下步骤： a. 使用权利要求1所述的检测试剂盒进行PCR扩增，条件如下：94°C预变性2min; 94°C20s，退火温度 55. 5°C30s，72°C20s，40 个循环； b. 结果分析 根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于35-40 为可疑，需重复检测；再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性；也可以依扩 增得到的Ct值根据标准曲线对起始样品中病毒含量进行准确定量。7. -种如权利要求6所述检测猪圆环病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR试剂盒的使 用方法，其特征在于所述实时荧光定量RT-PCR的反应体系为： a. OneStepRT-PCRbuffer:12· 5 份； b. 引物混合液3份 c. 酶混合物1份； d. 无RNA/DNA酶水 5. 5 份； e. 提取样品的RNA模板3份； f. 阳性对照pGM-173阳性质粒3份； g. 阴性对照无RNA/DNA酶水3份。8. 根据权利要求7所述的猪圆环病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR试剂盒，其特征
【专利摘要】一种用于检测猪圆环病毒PCV1的Taqman？Real-timePCR试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包含扩增预混液、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQ？ID？NO:1和？SEQ？ID？NO:2的引物及SEQ？ID？NO:3的探针引物的混合物，所述检测方法包括使用所述试剂盒进行RT-PCR扩增的步骤及评定标准。本发明设计了特异性针对PCV1的引物及探针，优化并组装成试剂盒。与普通RT-PCR方法相比，本发明省时、省力，成本较低，所述使用方法能快速、敏感、准确以及低成本地对猪圆环病毒PCV1进行检测及定量分析，该方法的建立对临床诊断PCV1和流行病学调查具有重要意义。
【IPC分类】C12Q1/68, C12R1/93, C12Q1/70
【公开号】CN105274256
【申请号】CN201510719725
【发明人】吴锦艳, 田宏, 尚佑军, 陈妍, 王光祥, 刘湘涛, 张志东, 栾志舫, 王耀杰, 臧金凤
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年10月30日